Le protocole de sauvetage des embryons est obligatoire pour la régénération des embryons immatures issus de croisements interspécifiques entre différentes espèces de Cucurbita. Il est le plus souvent utilisé pour les croisements entre Cucurbita moschata et Cucurbita pepo. Le principal avantage de cette technique est sa simplicité.
Le protocole utilise uniquement des milieux de SEP avec des antibiotiques. Par conséquent, il peut être facilement reproduit par n’importe quel laboratoire. Il serait possible de modifier cette technique pour étudier différents obstacles à l’hybridation interspécifique ou intergénérique.
Prêter attention aux détails à chaque étape sera utile pour un résultat réussi. Commencez par planter les plantes Cucurbita en remplissant 50 cellules de départ de 25 par 50 centimètres en utilisant un terreau complété par de l’engrais complet à base d’azote, de phosphore et de potassium, contenant 1,38 gramme par kilogramme d’azote, de phosphore et de potassium chacun. Ensuite, semez les graines à une profondeur égale à leur longueur et recouvrez-les avec le terreau.
Arrosez les appartements sans créer d’eau stagnante et gardez le média humide en les arrosant une fois par jour. À la fin du deuxième stade foliaire vrai, transplantez les plants dans des pots de 30 centimètres de diamètre complétés par trois cuillères à soupe d’engrais complet par pot. Après tous les sept jours, fertilisez chaque pot avec 500 millilitres d’engrais liquide contenant 20, 20, 20 azote, phosphore et potassium dans un gramme ajouté à un gallon d’eau.
Maintenez les plantes dans la serre à des températures comprises entre 22 et 28 degrés Celsius sous le régime de la lumière naturelle. Pour les génotypes de vining, prévoir un treillis de soutien dans la serre. Effectuer l’hybridation ou la pollinisation contrôlée dès que les plantes commencent à fleurir six à huit semaines après le semis.
Vérifiez les fleurs non ouvertes ayant une teinte jaune sur les pétales et identifiez les fleurs mâles et les fleurs femelles des cultivars Cucurbita pepo et Cucurbita moschata. Pour éviter la pollinisation accidentelle par les insectes, collez doucement la fleur fermée au sommet à l’aide de ruban de masquage. Le lendemain matin, effectuez la pollinisation avant 10h00 en retirant doucement la partie supérieure collée de la fleur mâle et femelle.
Séparer les pétales de la fleur mâle et transférer les pollens en frottant doucement l’anthère sur le stigmate de la fleur femelle. Après la pollinisation, fermez immédiatement la fleur femelle pollinisée avec du ruban de masquage et utilisez une étiquette pour enregistrer la date de pollinisation et indiquer les parents paternels et maternels utilisés dans le croisement. Un croisement réussi indiqué par un ovaire élargi formera un petit fruit en une semaine.
Récoltez les fruits après 45 à 55 jours de pollinisation. Préparez un stock de céfotaxime. Filtrez-le à travers un filtre à seringue stérile de 0,22 micron.
Et faites des aliquotes de 0,5 millilitre de 250 milligrammes par millilitre de céfotaxime avant de les stocker à moins 20 degrés Celsius. De même, préparez le stock d’ampicilline. Filtrez-le à travers un filtre à seringue stérile de 0,22 micron et préparez des aliquotes d’un millilitre de 100 milligrammes par millilitre d’ampicilline avant de les stocker à moins 20 degrés Celsius.
Préparer Murashige et Skoog, ou milieu MS en dissolvant 2,45 grammes du milieu dans 500 millilitres d’eau distillée dans une bouteille d’un litre. Ajouter 1,5 gramme de gomme gellane au milieu MS et autoclaver à 121 degrés Celsius pendant 20 minutes. Refroidissez le milieu en plaçant la bouteille dans un bain-marie à 50 degrés Celsius.
Décongeler les stocks d’antibiotiques à l’intérieur de l’armoire à flux laminaire. Transférer le flacon moyen dans la hotte à flux laminaire et ajouter 0,6 millilitre de bouillon de céfotaxime et 0,25 millilitre de bouillon d’ampicilline au milieu avec un mélange approprié. Versez environ sept millilitres du milieu dans une boîte de Petri stérile de 60 par 15 millimètres.
Laisser le milieu se solidifier dans les boîtes de Petri pendant environ 15 à 20 minutes. Fermez les boîtes de Petri avec une pellicule hertzicole et placez-les dans une boîte de rangement à température ambiante jusqu’à ce qu’elles soient utilisées ultérieurement. Récoltez les fruits de la courge en les coupant de la vigne principale et désinfectez les fruits en lavant leur surface dans l’évier de laboratoire à l’aide d’un détergent liquide comme 0,3% de chloroxylénol.
Rincez les fruits avec beaucoup d’eau du robinet et séchez-les avec des serviettes en papier propres avant de transférer les fruits dans l’armoire à flux d’air stratifié. Stérilisez la surface du fruit à l’intérieur de l’armoire en pulvérisant de l’éthanol à 70%. Couper le fruit en deux avec un couteau stérile et extraire les graines.
Utilisez des pinces ou des mains stériles avec des gants stériles pour ouvrir de manière aseptique le tégument et exposer les embryons immatures avant de les placer dans une boîte de Petri contenant un milieu de SEP supplémenté en antibiotiques. Scellez les plaques de Petri à l’aide d’un film d’emballage et placez-les dans une chambre de croissance ayant une température de 25 degrés Celsius, une période de photo de 16 heures et une humidité relative de 70%. En cas de contamination, sous-cultiver immédiatement les embryons non contaminés dans une nouvelle plaque ayant le même milieu.
Une fois que les racines sont développées après 10 à 14 jours, et que les cotylédons sont développés après 15 à 21 jours, retirez les plantules des boîtes de Petri et lavez doucement le milieu présent autour des racines avec de l’eau du robinet. Placez les plantules nettoyées dans un récipient en plastique de 14 centimètres sur 9 centimètres sur 4 et recouvrez les racines avec des serviettes en papier humides. Couvrez le contenant et réhumidifiez les serviettes en papier si nécessaire.
Gardez les contenants en plastique à 25 à 28 degrés Celsius, et pendant une période de photo de 16 heures pour acclimater les plantules tout en maintenant l’état humide des serviettes en papier. Après 7 à 10 jours d’acclimatation, transférer les semis de trois à quatre centimètres de long dans des appartements de 50 cellules contenant un terreau commercial amendé avec de l’engrais et les déplacer vers la serre. Évitez de trop arroser pour éviter la pourriture et ajoutez environ 10 à 20 millilitres d’eau par cellule au besoin.
Au deuxième au troisième stade foliaire vrai, transplantez les plantules dans des pots de 25 centimètres de diamètre remplis de terreau modifié avec de l’engrais et effectuez une hybridation contrôlée lorsque les plantes commencent à fleurir. Maintenez les plantes dans la serre à 22 à 28 degrés Celsius sous le régime de la lumière naturelle. Et évaluer les caractéristiques des plantes pour les fruits et les graines.
Quatre Cucurbita pepo et 11 Cucurbita moschata ont été choisis pour l’hybridation interspécifique. Sur 24 combinaisons croisées interspécifiques tentées, une nouaison a été obtenue pour 22 croisements représentant plus de 92% de succès dans la nouaison. Les croisements entre Cucurbita moschata et Cucurbita pepo impliquant les génotypes O et M, et les génotypes E et J, n’ont produit aucun fruit mûr.
Alors que le croisement entre Cucurbita moschata et Cucurbita pepo impliquant les génotypes F et J, a produit six fruits. Le nombre de fleurs pollinisées pour différentes combinaisons croisées variait de 1 à 11. Et le taux de réussite de la pollinisation variait de 0% à 100%Sur 44 fruits produits à partir de toutes les combinaisons croisées, un seul fruit d’un croisement entre Cucurbita moschata et Cucurbita pepo, les génotypes C et J ont produit des embryons immatures qui ont pu être sauvés.
Pour le développement de ces embryons peu développés, ils ont été cultivés à l’aide des milieux de sauvetage d’embryons, ce qui a entraîné un taux de réussite de 80% pour le sauvetage d’embryons. Les deux procédures les plus importantes sont l’identification des croisements compatibles entre deux espèces, à savoir Cucurbita moschata et Cucurbita pepo, et la régénération réussie des embryons. Étant donné que la technique de sauvetage d’embryons est simple et facilement reproductible, les éleveurs de courges du monde entier peuvent utiliser cette technique pour sauver des embryons immatures issus de croisements interspécifiques entre différentes espèces de Cucurbita.
