Il protocollo di salvataggio degli embrioni è obbligatorio per la rigenerazione di embrioni immaturi derivati da incroci interspecifici tra diverse specie di Cucurbita. È più comunemente usato per gli incroci tra Cucurbita moschata e Cucurbita pepo. Il principale vantaggio di questa tecnica è la sua semplicità.
Il protocollo utilizza solo supporti SM con antibiotici. Quindi, può essere facilmente replicato da qualsiasi laboratorio. Sarebbe possibile modificare questa tecnica per indagare diverse barriere all'ibridazione interspecifica o intergenerica.
Prestare attenzione ai dettagli durante ogni fase sarà utile per un risultato positivo. Inizia con la piantagione delle piante di Cucurbita riempiendo 50 celle di 25 per 50 centimetri usando un terriccio integrato con fertilizzante completo di azoto, fosforo e potassio, contenente 1,38 grammi per chilogrammo di azoto, fosforo e potassio ciascuno. Quindi, seminare i semi ad una profondità pari alla loro lunghezza e coprirli con il terriccio.
Innaffia gli appartamenti senza creare acqua stagnante e mantieni i media umidi annaffiandoli una volta al giorno. Alla fine della seconda fase della foglia vera, trapiantare le piantine in vasi di 30 centimetri di diametro integrati con tre cucchiai di fertilizzante completo per vaso. Dopo ogni sette giorni, concimare ogni vaso con 500 millilitri di fertilizzante liquido contenente 20, 20, 20 azoto, fosforo e potassio in un grammo aggiunto a un litro d'acqua.
Mantenere le piante nella serra a temperature comprese tra 22 e 28 gradi Celsius sotto il regime di luce naturale. Per vinare i genotipi, fornire un traliccio di supporto nella serra. Eseguire l'ibridazione controllata o l'impollinazione non appena le piante iniziano a fiorire a sei-otto settimane dalla semina.
Controlla i fiori non aperti che hanno una tonalità gialla sui petali e identifica i fiori maschili e i fiori femminili delle cultivar Cucurbita pepo e Cucurbita moschata. Per prevenire l'impollinazione accidentale degli insetti, nastro delicatamente il fiore chiuso nella parte superiore usando del nastro adesivo. La mattina seguente, effettuare l'impollinazione prima delle 10:00 rimuovendo delicatamente la parte superiore nastrata del fiore maschile e femminile.
Separare i petali dal fiore maschile e trasferire i pollini strofinando delicatamente l'antera sullo stigma del fiore femminile. Dopo l'impollinazione, chiudere immediatamente il fiore femminile impollinato con del nastro adesivo e utilizzare un tag per registrare la data di impollinazione e per indicare i genitori paterni e materni utilizzati nella croce. Una croce di successo indicata da un'ovaia espansa formerà un piccolo frutto entro una settimana.
Raccogliere il frutto dopo 45-55 giorni di impollinazione. Preparare un brodo di cefotaxime. Filtrarlo attraverso un filtro sterile a siringa da 0,22 micron.
E fare 0,5 millilitri aliquote di 250 milligrammi per millilitro cefotaxime prima di conservarli a meno 20 gradi Celsius. Allo stesso modo, preparare il brodo di ampicillina. Filtrarlo attraverso un filtro sterile a siringa da 0,22 micron e preparare aliquote da un millilitro di 100 milligrammi per millilitro di ampicillina prima di conservarli a meno 20 gradi Celsius.
Preparare Murashige e Skoog, o MS mezzo sciogliendo 2,45 grammi del mezzo in 500 millilitri di acqua distillata in una bottiglia da un litro. Aggiungere 1,5 grammi di gomma gellan al mezzo MS e sterilizzarlo in autoclave a 121 gradi Celsius per 20 minuti. Raffreddare il mezzo posizionando la bottiglia a bagnomaria a 50 gradi Celsius.
Scongelare le scorte di antibiotici all'interno dell'armadio a flusso laminare. Trasferire la bottiglia media sulla cappa a flusso laminare e aggiungere 0,6 millilitri di brodo cefotaxime e 0,25 millilitri di brodo di ampicillina al mezzo con una corretta miscelazione. Versare circa sette millilitri del mezzo in una capsula di Petri sterile da 60 x 15 millimetri.
Lasciare solidificare il terreno nelle piastre di Petri per circa 15-20 minuti. Chiudere le piastre di Petri con pellicola sigillante e metterle in una scatola a temperatura ambiente fino a un ulteriore utilizzo. Raccogli il frutto della zucca tagliandolo dalla vite principale e disinfetta il frutto lavando la sua superficie nel lavandino del laboratorio usando un detergente liquido come lo 0,3% di cloroxilenolo.
Risciacquare la frutta con abbondante acqua di rubinetto e asciugarla con carta assorbente pulita prima di trasferire la frutta nell'armadio di flusso d'aria laminato. Sterilizzare la superficie della frutta all'interno dell'armadio spruzzando il 70% di etanolo. Taglia in due il frutto con un coltello sterile ed estrai i semi.
Utilizzare una pinza sterile o mani con guanti sterili per aprire asetticamente il rivestimento del seme ed esporre gli embrioni immaturi prima di metterli in una capsula di Petri contenente MS Medium con antibiotici. Sigillare le piastre di Petri con pellicola avvolgente e posizionarle in una camera di crescita con temperatura di 25 gradi Celsius, periodo fotografico di 16 ore e umidità relativa del 70%. In caso di contaminazione, sottocoltivare immediatamente gli embrioni non contaminati in una nuova piastra avente lo stesso mezzo.
Una volta che le radici sono sviluppate dopo 10-14 giorni e i cotiledoni si sono sviluppati dopo 15-21 giorni, rimuovere le piantine dalle piastre di Petri e lavare delicatamente via i mezzi presenti intorno alle radici usando acqua di rubinetto. Metti le piantine pulite in un contenitore di plastica 14 per 9 per 4 centimetri e copri le radici con asciugamani di carta bagnati. Coprire il contenitore e inumidire nuovamente gli asciugamani di carta quando necessario.
Mantenere i contenitori di plastica a 25-28 gradi Celsius e in un periodo fotografico di 16 ore per acclimatare le piantine mantenendo le condizioni umide degli asciugamani di carta. Dopo 7-10 giorni di acclimatazione, trasferire le piantine lunghe da tre a quattro centimetri in 50 appartamenti contenenti terriccio commerciale modificato con fertilizzante e spostarle nella serra. Evitare l'irrigazione eccessiva per evitare la decomposizione e aggiungere circa 10-20 millilitri di acqua per cella, se necessario.
Dal secondo al terzo stadio di foglia vera, trapiantare le piantine in vasi di 25 centimetri di diametro riempiti con terriccio modificato con fertilizzante ed eseguire un'ibridazione controllata quando le piante iniziano a fiorire. Mantenere le piante nella serra a 22-28 gradi Celsius sotto il regime di luce naturale. E valuta le piante per le caratteristiche di frutta e semi.
Quattro Cucurbita pepo e 11 Cucurbita moschata sono stati scelti per l'ibridazione interspecifica. Su 24 combinazioni incrociate interspecifiche tentate, è stata ottenuta un'allegagione per 22 incroci che rappresentano oltre il 92% di successo nell'allegagione. Gli incroci tra Cucurbita moschata e Cucurbita pepo che coinvolgono i genotipi O e M, e i genotipi E e J, non hanno prodotto frutti maturi.
Mentre l'incrocio tra Cucurbita moschata e Cucurbita pepo che coinvolge i genotipi F e J, ha prodotto sei frutti. Il numero di fiori impollinati per diverse combinazioni incrociate variava da 1 a 11. E il tasso di successo dell'impollinazione variava dallo 0% al 100% Su 44 frutti prodotti da tutte le combinazioni incrociate, solo un frutto da un incrocio tra Cucurbita moschata e Cucurbita pepo, i genotipi C e J hanno prodotto embrioni immaturi che potevano essere salvati.
Per lo sviluppo di questi embrioni poco sviluppati, sono stati coltivati utilizzando i mezzi di salvataggio degli embrioni, il che ha portato a un tasso di successo dell'80% per il salvataggio degli embrioni. Le due procedure più importanti sono l'identificazione di incroci compatibili tra due specie, vale a dire Cucurbita moschata e Cucurbita pepo, e la rigenerazione embrionale di successo. Poiché la tecnica di salvataggio degli embrioni è semplice e facilmente replicabile, gli allevatori di zucche di tutto il mondo possono utilizzare questa tecnica per salvare embrioni immaturi derivati da incroci interspecifici tra diverse specie di Cucurbita.
