Протокол спасения эмбрионов является обязательным для регенерации незрелых эмбрионов, полученных из межвидовых скрещиваний между различными видами Cucurbita. Он чаще всего используется для скрещивания между Cucurbita moschata и Cucurbita pepo. Главным преимуществом данной методики является ее простота.
Протокол использует только носители РС с антибиотиками. Следовательно, он может быть легко воспроизведен любой лабораторией. Можно было бы модифицировать этот метод для исследования различных барьеров на пути межвидовой или межродовой гибридизации.
Обращая внимание на детали на каждом шагу, это будет полезно для успешного результата. Начните с посадки растений Cucurbita, заполнив 50 начальных ячеек размером 25 на 50 сантиметров с использованием горшечной среды, дополненной полным азотом, фосфором и калийным удобрением, содержащим по 1,38 грамма на килограмм азота, фосфора и калия каждый. Далее посейте семена на глубину, равную их длине, и накройте их горшечной средой.
Поливайте квартиры, не создавая стоячей воды, и сохраняйте среду влажной, поливая их один раз в день. В конце второй стадии истинного листа пересадите рассаду в горшки диаметром 30 сантиметров, дополненные тремя столовыми ложками полного удобрения на горшок. Через каждые семь дней удобряйте каждый горшок 500 миллилитрами жидкого удобрения, содержащего 20, 20, 20 азота, фосфора и калия в одном грамме, добавленном к галлону воды.
Поддерживайте растения в теплице при температуре от 22 до 28 градусов цельсия в режиме естественного освещения. Для винных генотипов предусмотреть опорную шпалеру в теплице. Выполняйте контролируемую гибридизацию или опыление, как только растения начинают цвести через шесть-восемь недель после посева.
Проверьте нераскрытые цветы, имеющие желтый оттенок на лепестках, и определите мужские цветы и женские цветы сортов Cucurbita pepo и Cucurbita moschata. Чтобы предотвратить случайное опыление насекомыми, аккуратно заклейте закрытый цветок наверху с помощью маскировочной ленты. На следующее утро проведите опыление до 10:00 утра, аккуратно удалив заклеенную верхнюю часть мужского и женского цветка.
Отделение лепестков от мужского цветка и перенос пыльцы путем осторожного растирания пыльника о женское цветочное рыльце. После опыления немедленно закройте опыляемый женский цветок маскировочной лентой, и используйте метку, чтобы записать дату опыления и указать отцовских и материнских родителей, используемых в кресте. Успешное скрещивание, обозначенное расширенным завязью, сформирует небольшой плод в течение одной недели.
Соберите плоды после 45-55 дней опыления. Подготовьте цефотаксим. Процедите его через стерильный шприцевой фильтр 0,22 мкм.
И сделайте 0,5 миллилитра аликвоты по 250 миллиграммов на миллилитр цефотаксима перед хранением их при минус 20 градусах Цельсия. Аналогично готовят запас ампициллина. Процедите его через стерильный шприцевой фильтр 0,22 микрона и приготовьте одну миллилитровую аликвоту по 100 миллиграммов на миллилитр ампициллина перед хранением их при минус 20 градусах Цельсия.
Приготовьте Мурашиге и Скуг, или MS-среду, растворив 2,45 грамма среды в 500 миллилитрах дистиллированной воды в литровой бутылке. Добавьте 1,5 грамма геллановой камеди в среду MS и автоклавируйте ее при 121 градусе Цельсия в течение 20 минут. Охладите среду, поместив бутылку на водяную баню при 50 градусах Цельсия.
Разморозьте запасы антибиотиков внутри ламинарного проточного шкафа. Переложите средний флакон на ламинарную вытяжку и добавьте 0,6 миллилитра цефотаксима и 0,25 миллилитра ампициллинового бульона в среду при правильном перемешивании. Налейте около семи миллилитров среды в стерильную чашку Петри размером 60 на 15 миллиметров.
Дайте среде затвердеть в чашках Петри в течение примерно 15-20 минут. Закройте чашки Петри герметичной пленкой и поместите их в ящик для хранения комнатной температуры до дальнейшего использования. Соберите плоды кабачков, отрезав их от основной лозы, и продезинфицируйте плоды, промыв их поверхность в лабораторной раковине с использованием жидкого моющего средства, такого как 0,3% хлороксиленола.
Промойте фрукты достаточным количеством водопроводной воды и высушите их чистыми бумажными полотенцами, прежде чем переносить фрукты в шкаф для ламината. Стерилизуйте поверхность плодов внутри шкафа, распыляя 70% этанола. Разделите плоды пополам стерильным ножом и извлеките семена.
Используйте стерильные щипцы или руки со стерильными перчатками, чтобы асептически открыть семенную оболочку и обнажить незрелые эмбрионы, прежде чем поместить их в чашку Петри, содержащую MS Medium, дополненную антибиотиками. Запечатайте пластины Петри с помощью упаковочной пленки и поместите их в камеру роста с температурой 25 градусов цельсия, 16-часовым периодом фото и относительной влажностью 70%. В случае загрязнения немедленно субкультуру незагрязненных эмбрионов в новую пластину, имеющую ту же среду.
После того, как корни развиваются через 10-14 дней, а семядоли развиваются через 15-21 день, удалите растения из чаши Петри и аккуратно смойте среду, присутствующую вокруг корней, используя водопроводную воду. Поместите очищенные салфетки в пластиковый контейнер размером 14 на 9 на 4 сантиметра и накройте корни влажными бумажными полотенцами. Накройте контейнер и при необходимости повторно смочите бумажные полотенца.
Держите пластиковые контейнеры при температуре от 25 до 28 градусов по Цельсию, а в течение 16-часового фотопериода акклиматизировать саженцы, сохраняя при этом влажное состояние бумажных полотенец. После 7-10 дней акклиматизации перенесите саженцы длиной от трех до четырех сантиметров в 50-клеточные квартиры, содержащие коммерческую горшечную смесь, дополненную удобрением, и переместите их в теплицу. Избегайте чрезмерного полива, чтобы предотвратить гниение, и добавляйте примерно от 10 до 20 миллилитров воды на ячейку по мере необходимости.
На второй-третьей стадии истинного листа пересадите рассаду в горшки диаметром 25 сантиметров, заполненные горшечной средой, дополненной удобрением, и выполните контролируемую гибридизацию, когда растения начнут цвести. Поддерживайте растения в теплице при температуре от 22 до 28 градусов Цельсия при естественном освещении. И оцените растения по характеристикам плодов и семян.
Четыре Cucurbita pepo и 11 Cucurbita moschata были выбраны для межвидовой гибридизации. Из 24 попытавшихся межвидовых комбинаций скрещиваний был получен набор фруктов для 22 скрещиваний, представляющих более 92% успеха в наборе фруктов. Скрещивания между Cucurbita moschata и Cucurbita pepo с участием генотипов O и M, а также генотипов E и J, не дали зрелых плодов.
В то время как скрещивание между Cucurbita moschata и Cucurbita pepo с участием генотипов F и J произвело шесть плодов. Количество цветков, опыляемых для различных поперечных комбинаций, варьировалось от 1 до 11. А успешность опыления варьировалась от 0% до 100% Из 44 плодов, полученных из всех перекрестных комбинаций, только один плод из помеси Cucurbita moschata и Cucurbita pepo, генотипы C и J произвели незрелые эмбрионы, которые можно было спасти.
Для развития этих плохо развитых эмбрионов их культивировали с использованием среды спасения эмбрионов, что привело к 80%-ному успеху в спасении эмбрионов. Двумя наиболее важными процедурами являются выявление совместимых скрещиваний между двумя видами, а именно Cucurbita moschata и Cucurbita pepo, и успешная регенерация эмбриона. Поскольку метод спасения эмбрионов прост и легко воспроизводится, селекционеры сквоша во всем мире могут использовать этот метод для спасения незрелых эмбрионов, полученных из межвидовых скрещиваний между различными видами Cucurbita.
