この方法では、力は核に直接加えられます。これにより、細胞原形質膜と細胞骨格からの力伝達効果が切り離され、核メカノセンシングの分子メカニズムが明らかになります。力は非侵襲的な方法で生細胞内に加えられます。
光ピンセットと比較して、磁場と磁力は細胞の機能に影響を与えず、より高いスループットを持っています。平均直径7マイクロメートルのカルボニル鉄マイクロビーズを0.2グラム秤量して、磁気マイクロビーズで細胞の培養を開始します。ピペットを使用して、マイクロビーズを1ミリリットルのRPMI 1640培養培地に懸濁します。
次に、B2B細胞を含むペトリ皿をバイオセーフティキャビネットに入れ、マイクロビーズを含む培地200マイクロリットルをペトリ皿にすばやく追加します。マイクロビーズが細胞によって内在化されるまで、ペトリ皿をインキュベーターに入れます。倒立顕微鏡を開き、共焦点蛍光イメージングを使用して、マイクロビーズ、核、および細胞境界を視覚化することにより、6時間ごとに細胞株の内在化に最適な時間を決定します。
内部化されたマイクロビーズは細胞境界内に存在します。小荷重アプリケーションと生細胞イメージングの場合は、ソフトウェアアプリケーションElementsを開きます。構成磁気検索を定義するには、1 over 2 ボタンをクリックして、スキャン速度を 2 秒ごとに 1 フレームに設定します。
ピンホールサイズを1.2エアリー単位に設定します。FITCチャンネルのみを確認し、PMT HVを70、オフセットをゼロ、レーザー強度を10に設定します。構成磁気YAP核を定義するには、1つ上の4つのボタンをクリックして、スキャン速度を4秒ごとに1フレームに設定します。
次に、1.2エアリーユニットボタンをクリックしてピンホールサイズを1.2エアリーユニットに設定し、FITCチャネルを確認します。PMT HVを70、オフセットをゼロ、レーザー強度を10に設定します。核境界と核染色強度をイメージングするには、シアニン5チャネルを確認してください。
1.2エアリーユニットボタンをクリックして、PMT HVを70、オフセットをゼロ、レーザー強度を10に設定しないでください。ピンホールサイズは、3次元YES関連タンパク質イメージング用に最適化されます。次に、要素を介してDIAをオンにします。
スピンビューを開き、明視野を使用してオブジェクトの焦点を調整し、セルの焦点が合っている鮮明な画像を取得します。10倍の対物レンズを使用して、内部に単一のマイクロビーズがあるセル、内部に複数のマイクロビーズがあるセル、内部にマイクロビーズがないセルなど、3つの条件で適切な複数の単一セルを見つけます。次に、40X対物レンズに切り替えて、この位置に適切な位置番号を付けます。
要素を開き、磁気検索をクリックし、インターロックを解除してからタブをスキャンし、上ボタンと下ボタンを選択して焦点面のZ位置を調整し、選択したセルのZスタックの下限と上限を設定します。もう一度 [スキャン] をクリックしてスキャンを停止します。磁気 YAP 核構成に切り替え、ファイル名を before_small_force.nd2 に設定します。
記録されたZスタックの実行ボタンをクリックします。正しい光路に切り替えてDIAをオンにします。 スピンビューを開き、録音ボタンをクリックします。
磁石移動装置のノブを回して、磁石をペトリ皿の底から46ミリメートル上に移動します。ビデオを保存してチェックし、磁力によって誘発されるマイクロビーズの変位を確認します。ファイル名をafter_small_force.nd2に設定して、スキャン手順を繰り返します。
次に、正しい光路に切り替え、DIAをオンにしてスピンビューを開き、録音ボタンをクリックします。磁石移動装置のノブをペトリ皿の底から最大120ミリメートル上に回転させ、明視野画像シーケンスまたはビデオを保存します。ファイル名を before_large_force.nd2 に設定して、スキャンの手順を繰り返します。
マイクロビーズは、FITCまたはシアニン5チャネルのレーザー励起下で蛍光を発することはできません。したがって、インターナライズされたマイクロビーズは、YES関連タンパク質および核の蛍光の共焦点イメージングに位置する暗くぼみによって同定された。核の円形度は、コントロール細胞とマイクロビーズのインターナリゼーションを有する細胞との間に有意差を示さなかった。
マイクロビーズと共培養したがインターナリゼーションを行わなかったコントロール細胞とマイクロビーズインターナリゼーションを行った細胞のYES関連タンパク質細胞核と細胞質比も有意差を示さなかった。アクチンの核の変形と脱重合は、細胞骨格含有細胞のマイクロビーズによって加えられた圧縮力によって引き起こされました。定量的AFM力変位関係により提供される定量的イメージング解析検量線。
この関係に基づいて、ビーズの加わる力を推定した。核の変形とYES関連タンパク質の転座は、磁力の適用または解放で観察されました。緑チャネルではYES関連タンパク質の強度変化、赤チャネルでは核染色に変化がないことから、YES関連タンパク質の転座による磁力誘発核変形が引き起こされることが確認された。
2群内のYES関連タンパク質核対細胞質比の正味変化を定量化した結果、細胞質内のマイクロビーズに加えられた磁力がYES関連タンパク質転座を誘導し、YES関連タンパク質核と細胞質比を変化させることが確認された。力を加えてイメージングする前に、細胞が磁気マイクロビーズを内在化させ、ビーズが細胞境界内にあることを確認してください。
