このプロトコールは、筋肉におけるこの遺伝子の機能をさらに研究するために、任意の遺伝子における筋細胞ノックアウトの開発を可能にする。利点は、遺伝子を研究するためのノックアウト動物の開発よりも安価で速いことです。この技術は、例えば、ミオパチーにおける新たに同定された遺伝子の関与を研究するために使用することができる。
ここで説明した技術をiPS細胞に応用すれば、あらゆるタイプの細胞の任意の遺伝子に対するノックアウト細胞の開発につながる可能性がある。間隔をあけた短い回文反復またはCRISPR媒介遺伝子欠失の規則的なクラスター化を開始するには、まずensemblのようなゲノムブラウザツールを使用する。org を使用して、標的遺伝子とその両側の DNA 配列を識別します。
遺伝子エクソンのリストを取得するには、まずタンパク質コード配列の転写産物をクリックし、次にエクソンをクリックします。次に、[配列のダウンロード]をクリックし、ゲノム配列のみを選択して、遺伝子全体の完全なコンセンサス配列をダウンロードします。遺伝子のエクソンとイントロンのリストをスクロールして、標的のものを選択します。
ガイドRNAを設計するために、まず標的配列のすぐ上流および下流のイントロンの塩基配列を選択する。次に、crispr.teforなどのWebサイトにアクセスします。選択した配列を正味で使用して、数百塩基対で区切られたプロトスペーサー隣接モチーフなしでそれぞれ20ヌクレオチド長の2つのガイドRNAを設計します。
次に、各ガイドRNAの逆相補配列を決定し、プライマーを順序付ける。プラスミドクローニング用のガイドRNAカセットを構築するには、まず本文に記載のレシピとプログラムを使用して1組のプライマーでPCRを実行し、次にトリスホウ酸-EDTAバッファーを使用してPCR産物を1%アガロースゲルで分離します。次に300塩基対断片を切除し、キットを用いて精製する。
同様に、他のプライマーセットで別のPCRを実行した後、400塩基対の長さのDNA断片を20マイクロリットルの溶出バッファーに精製する。ガイドRNAカセットをレンチウイルスプラスミド骨格に挿入するには、まず、本文に記載されるように、プラスミドと制限酵素Xma1およびBlp1との二重消化反応をセットアップする。反応管を摂氏37度で1時間インキュベートした後、65°Cで20分間インキュベートし、消化産物を1%アガロースゲル中で泳動させ、適当なキットを用いて約10キロ塩基対のプラスミドを精製する。
また、光学濃度を測定することにより精製物を定量する。ガイドRNAカセットをプラスミドと連結するには、精製したガイドRNA、直鎖状化したプラスミドDNA、酵素、および水との反応混合物を最終容量10マイクロリットルに調製し、次いで反応管を摂氏50度で15分間インキュベートして、pGuideと呼ばれる最終プラスミドを生成する。レンチウイルス産生のために、まず、10%FBSおよび1%ペニシリンまたはストレプトマイシンを添加した高グルコースおよびピルビン酸を含むDMEM中の100万HEK 293細胞を含む145センチメートルプレートを播種する。
その後、細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素インキュベーターで3日間増殖させます。4日目に細胞をチェックして、60〜65%のコンフルエンシーを確認します。次に、目的のプラスミド、ウイルスエンベロープをコードするプラスミド、レンチウイルスパッケージングプラスミドpsPAX2、およびリン酸カルシウムからなるトランスフェクション溶液を調製する。
水で最終容量を1000マイクロリットルに調整します。次いで、トランスフェクション溶液を攪拌下で1ミリリットルの2X HBSに滴下し、室温で少なくとも10分間インキュベートする。その後、溶液を細胞に滴下する。
トランスフェクション溶液を均質に分配するには、プレートを全方向に静かに傾け、次に細胞を摂氏 37 度で 5% の二酸化炭素インキュベーターで少なくとも 5 時間インキュベートします。次に、プレートから培地を取り出し、PBSで細胞を洗浄してトランスフェクション試薬を取り除き、12ミリリットルの新鮮な培地を加えます。摂氏37度で48時間のインキュベーション後、すべてのプレートからチューブに培地をプールします。
チューブを密閉バケットに入れ、800倍Gで4°Cで5分間遠心分離し、次いで0.45マイクロメートルフィルターを用いて上清を濾過し、濾液を68、300倍Gで4°Cで2時間遠心分離し、スイングバケットローターを用いて。上澄み液を除去した後、ペレットから液体を最大限除去するために、安全キャビネット内のペーパータオルの上でチューブを逆さまにして5〜10分間保持する。100マイクロリットルのHEC増殖培地を加え、チューブを摂氏4度に少なくとも2時間保持する。
次いで、ピペッティングによってペレットを再懸濁する。再懸濁したペレットをすべて回収した後、10または25マイクロリットルのアリコートを作り、液体水素で急凍結した後、マイナス80°Cでアリコートを保管します。筋芽細胞形質導入のために、まず、96ウェルプレートの各ウェルを、10,000個の筋芽細胞を含む100マイクロリットルの増殖培地で播種する。
翌日、事前に計算されたLVガイドとLV Cas9を安全キャビネット内のセルに追加します。5日間のインキュベーション後、トリプシンを加えてウェルから細胞を放出する。細胞数を数えた後、40〜50%のコンフルエンシーを有するウェルから新しいプレートに細胞を移す。
5時間のインキュベーションの後、計算された量のLVキラーを20の感染の多重度で加え、5〜10日間、またはその間に少なくとも2つの継代でインキュベートする。カルシウムイメージングによる遺伝子編集クローンの機能的特徴付けのために、ラミニンコーティングされた35ミリメートルディッシュの中央に50,000個の細胞をプレートする。分化を誘導するには、本文中に記載した分化培地を添加する。
6日間のインキュベーション後、培養液を取り出し、疎水性ペンで細胞を描写する。次いで、分化培地で1対1に希釈した50マイクロリットルのFluo-4 Directを、分化した筋管に加える。ディッシュを摂氏37度で30分間インキュベートした後、グルコース1ミリリットルあたり1ミリグラムを添加したクレブス緩衝液で細胞を2回洗浄する。
次に、倒立蛍光顕微鏡または10倍の対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用して、1秒あたり1フレームの速度で90秒間蛍光変動を測定し、少なくとも10個の筋管を有するフィールドを選択する。追加のKrebs緩衝液を除去した後、膜脱分極のために2ミリリットルの塩化カリウムまたは2ミリリットルのフロロクロラールメタクレゾールまたは4cmCまたはRyR1直接刺激で細胞を刺激する。刺激後の蛍光変動を可視化し、次いで各筋管における蛍光変動を定量化する。
このプロトコルは、ヒト筋芽細胞から遺伝子RyR1をノックアウトするために首尾よく使用することができ、その結果、細胞内のゲノムDNAが短くなった。RyR1ノックアウトは、ウエスタンブロッティングにより標的細胞ではRyR1タンパク質が検出できなかったため、タンパク質レベルでも確認された。RyR1ノックアウト細胞から分化した筋管におけるRyR1活性の不在を、4cmCによる直接RyR1刺激または塩化カリウム誘導膜脱分極による間接刺激後のFluo-4カルシウムイメージングによってさらに検証した。
削除される配列は、機能性タンパク質の予測に必要であるべきである。この技術は、筋肉疾患における新しい遺伝子の関与を研究するためのポストゲノムツールの開発に理想的である。
