Borreliella burgdorferiのin vitro転写アッセイシステムは、研究者がRNAポリメラーゼの酵素活性を支配する遺伝子調節メカニズムと因子を研究するための生化学的ツールを提供します。このシステムにより、転写因子、補因子、塩濃度、pHがボレリエラ・ブルグドルフェリRNAポリメラーゼの機能にどのように影響するかをテストでき、遺伝子制御メカニズムの全体的な理解に貢献します。この強力な技術により、RNAポリメラーゼを選択的に阻害する薬物をスクリーニングすることもでき、ライムボレリア症を治療するための新薬の開発への扉が開かれます。
はじめに、2〜4リットルのボレリエラ・ブルグドルフェリRpoC-His10Xを微好気性環境でBSKII培地で培養し、1ミリリットルあたり10定数の2〜4倍の密度で細胞ペレットを収集します。細胞を10, 000倍Gで500ミリリットルの遠心ボトル中で摂氏4度で30分間ペレット化し、上清を捨てる。次いで、細胞を30ミリリットルの氷冷HN緩衝液に再懸濁し、遠心分離工程を繰り返し、上清をデカントした。
作業中は、凍結しない限り、細胞、ライセート、および精製タンパク質を摂氏4度または氷上で維持します。使用するすべてのバッファーに2ミリモルの濃度で新たに調製したジチオスレイトールを添加し、pH 8.0を維持することにより、RNAポリメラーゼを還元環境に保ちます。市販の細菌溶解キットを使用して、ボレリエラ・ブルグドルフェリ細胞ペレットからライセートを調製します。
プロテアーゼ阻害剤を含まない10〜15ミリリットルのB-PER溶液にペレットを再懸濁し、氷上で5分間溶解を進行させます。溶解溶液にプロテアーゼ阻害剤カクテルを追加し、超音波処理の3ラウンドを進めます。次に、50ミリリットルの遠沈管を使用した遠心分離とろ過によって細胞溶解液を清澄化します。
コバルトカラムローディングバッファーを溶液に加え、総容量を最大30ミリリットルにします。細胞残渣を20, 000倍Gで30分間遠心分離してペレット化する。その後、0.45マイクロメートルのシリンジフィルターを使用して上清をろ過し、ライセートとコバルトカラムローディングバッファーを最終希釈比1:10に希釈します。
製造元の指示に従って、コバルトまたはニッケル樹脂カラムを使用して、清澄化された細胞ライセート上清に対してアフィニティークロマトグラフィーを実行します。フロースルー、洗浄、溶出したサンプルを分析用に保存します。直ちにRNAポリメラーゼ溶液の緩衝液と保存緩衝液と交換し、製造元の指示に従って緩衝液交換カラムを使用します。
次に、10キロダルトンカットオフ遠心フィルターユニットを使用して、RNAポリメラーゼをミリリットルあたり0.2〜0.4ミリグラムの濃度に濃縮します。分光光度計で濃度を決定し、凍結ストックを準備します。20〜50マイクロリットルの量のRNAポリメラーゼ凍結ストックをPCRチューブに分注し、RNAポリメラーゼを摂氏マイナス80度で保管します。
放射線汚染を減らすために、放射線ベンチを含む作業面を準備します。新鮮なRNAポリメラーゼとRpoDストックを氷上で解凍し、ピペッティングの前に解凍したすべての凍結ストックを完全に混合します 実験要件に従って、放射性標識ヌクレオチド用の別のNTP混合物でマスター反応混合物を調製します。実験セット内のコントロール反応をPCRチューブに分注します。
水、反応ミックス、RNAポリメラーゼ、およびRpoDを指定されたPCRチューブに分注した後、ピペッティングによって試薬を混合します。調製した材料を放射線ベンチに移し、α-32P標識ATPをNTPに加え、穏やかにピペッティングして混合します。in vitro転写反応混合物を含むチューブにNTPを添加し、DNAテンプレートを追加してin vitro転写反応を開始します。
穏やかにピペッティングして反応量を混合し、サーモサイクラーまたはヒートブロックで37°Cで5分間チューブをインキュベートします。サーモサイクラーまたはヒートブロックから反応物を取り出し、50%ホルムアミドを含む等量の2X RNAローディング色素を反応混合物に添加して、in vitro転写反応を停止します。サーモサイクラーまたはヒートブロック中で65°Cで5分間反応をインキュベートすることによる酵素の変性。
ゲル電気泳動を使用して、in vitro転写RNAを10%〜15%TBE尿素ポリアクリルアミドゲル中で180ボルトで30〜45分間分離します。取り込まれていない放射性標識ATPを含むゲルの任意の部分を除去した後、ゲルをホスホスクリーンに一晩さらし、ホスホスクリーンイメージャーを使用して放射性標識RNAを画像化します。SDS-PAGEは、RNAポリメラーゼ複合体の3つのペプチド、RpoC、RpoB、およびRpoAに対応する3つのバンドを示しました。
MBPタグ付き組換え体Borreliella burgdorferi RpoDのサイズに一致する115キロダルトンのペプチドも観察された。第XA因子プロテアーゼによるタンパク質混合物の切断は、RpoDとMBPの2つの重要な産物の生成につながりました。ボレリエラ・ブルグドルフェリFLGBのプロモーター部位をPCRにより作製した。
RpoD濃度を2倍に希釈すると、蓄積されたRNA産物のレベルが低下します。RNAポリメラーゼ濃度が低いと、RpoD濃度の範囲全体でRNA産物が少なくなります。デンシトメトリーシグナルは、両方の実験において反応中に存在するRpoDの量の間の線形関係を示した。
RNAポリメラーゼの酵素活性は、精製、保存、および実験プロセス中のさまざまな要因に敏感です。新鮮な酵素と試薬は、適切な計画とともに、このプロトコルで成功する可能性を最大限に高めます。
