פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה ליצירה, תחזוקה וניתוח אופטי של כדורי לב. ספרואידים לבביים אלה חיוניים כדי למלא את הפער הנוכחי במודלים של מחלות חוץ גופיות. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים ליצור הדור הבא, סינון בתפוקה גבוהה ואחסון פונקציונלי של כדורי לב.
התחל בהוספת מיליליטר אחד לסנטימטר רבוע של תמיסת ניתוק לב סטרילית לכל באר של צלחת תרבית המכילה קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים המופקים מתאי גזע המושרים על ידי אדם. דוגרים על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. אשר את ניתוק התאים על ידי התבוננות בתאים לבנים ועגולים תחת הגדלה פי 4 של מיקרוסקופ שדה בהיר.
באמצעות פיפטה של חמישה מיליליטר, נתק מכנית את התאים על ידי שטיפתם עם שני מיליליטר של מדיום בסיסי חם כדי להכין תרחיף תא יחיד. מעבירים את מתלה התא לצינור חרוטי בקוטר 15 מיליליטר, ולצנטריפוגה למשך שלוש דקות במשקל 300 גרם. לאחר מכן שאפו את הסופרנטנט, והשהו מחדש את התאים במיליליטר אחד של ציפוי מחדש hiPSC-CM.
השתמש 1, 000 מיקרוליטר פיפטה קצה כדי לנתק את גלולת התא. לאחר שלוש או ארבע תערובות, מכיוון שהתמיסה נראית הומוגנית, טען אותה לקסטה כדי לספור את התאים, והעבר את כמות התאים המתאימה ב -100 מיקרוליטר של מדיום ציפוי מחדש לכל באר של צלחת חיבור נמוכה במיוחד, תחתית עגולה, 96 בארות. הניחו את לוחית כדורי הלב על שייקר אורביטלי באינקובטור ב-70 סל"ד עם טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, 21% חמצן ו-90% לחות למשך 24 שעות.
כדי למנוע קרע ספרואידי, לשאוף רק 50 מיקרוליטר של בינוני מכל באר, ולהוסיף 100 מיקרוליטר של RPMI בתוספת B27 בינוני לכל באר במשך 48 השעות הראשונות. לאחר מכן, שואפים 100 מיקרוליטר של המדיום מכל באר, ומוסיפים 100 מיקרוליטר של מדיום ההתבגרות לכל באר. לשמור על התאים במדיום ההבשלה, ולרענן את המדיום כל יומיים-שלושה.
מניחים את צלחת הספרואיד על קרח במשך 10 דקות לקירור מקדים לפני צנטריפוגה במשך שלוש דקות ב 70 גרם. מוציאים את המדיום עד 50 מיקרוליטר נשארים בבאר. לאחר מכן להוסיף 200 מיקרוליטר של hiPSC קר כקרח הקפאה בינוני לכל באר.
אטמו את הצלחת בסרט איטום צלחת. כדי להכין את תבנית הסיליקון, מערבבים את רכיבי ערכת אלסטומר הסיליקון ביחס של 10 ל-1, ומוסיפים את התמיסה בתוך החלק התחתון של צלחת הבאר. נטרלו את הבועות של התמיסה באמצעות משאבת ואקום למשך 15 עד 20 דקות.
מכניסים את התבנית לתנור, ומרפאים אותה בחום של 60 מעלות למשך שמונה שעות לקבלת אלסטומר גמיש למחצה שמתקלף מהצלחת. הכניסו את הצלחת האטומה בזהירות לתבנית סיליקון, תוך הבטחת חילופי חום אחידים בין צלחת הבאר למקפיא. מקפיאים את הצלחת בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות בתבנית סיליקון מוכנה לפני העברת הצלחת למיכל חנקן נוזלי או למקפיא של 150 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
כדי להבטיח הפשרה מהירה של ספרואידים לבביים, אספו צלחת תא אחת עם ספרואידים לבביים בכל פעם מהחנקן הנוזלי, והניחו אותה באינקובטור למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם 5% פחמן דו חמצני, 21% חמצן ו-90% לחות. מוציאים את סרט האיטום מהצלחת, ושואבים 150 מיקרוליטר מכל באר לפני הוספת 200 מיקרוליטר של מדיום בזאלי חם לכל באר. צנטריפוגג את הצלחת ב 70 גרם במשך שלוש דקות, ולחזור על כביסה בינונית בסיסית חמה.
לאחר שתסיים, להסיר 150 מיקרוליטר של המדיום, ולהוסיף 200 מיקרוליטר של cardiomyocytes מפשיר בינוני בכל באר. לאחר מכן חזור על שטיפת RPMI כאמור במהלך יצירת כדורית הלב, ולאחר מכן שמירה על התאים במצע ההתבגרות. לאחר שבוע של תרבית, ספרואידים לב מופשרים הם אופטימליים לטיפול בסידן הדמיה אופטית.
שאפו 150 מיקרוליטר מכל באר. טפלו בכדורי הלב המופשרים עם 100 מיקרוליטר של צבע סידן Cal-520 AM בינוני לכל באר בתנאים חשוכים, ודגרו על הצלחת במשך 60 דקות. הכינו מערכת לאיסוף וניתוח סידן על ידי הפעלת המיקרוסקופ והבטחת האפשרות לבקרה סביבתית.
כוונן את מידות צמצם המצלמה והמסגור כדי למזער את שטח הרקע. כדי למדוד את אות הסידן, באמצעות לייזר של 488 ננומטר, הגדר את הניגודיות לרקע שחור עם אות ירוק בהיר במהלך שחרור הסידן. הקלט סרטון עם זרם עקבי של 2 עד 10 פסגות תוך 10 שניות.
הקליטו סרטון של 10 שניות, וסרקו את הצלחת בעלת 96 הבארות, בתחילה זוזו שמאלה, ואז מטה בצורה זיגזגית כדי לכסות את הצלחת כולה. לאחר רכישת מעברי הסידן, נתח את הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח עקבות פלואורסצנטיות. כדורי הלב רכשו מבנה תלת-ממדי ביום הראשון שלאחר הזריעה, שניתן היה לגדל בתרבית עד שישה שבועות.
רוב הספרואידים הלבביים בני שלושה שבועות ביטאו ארגון סרקומר קבוע עם אלפא אקטינין וטרופונין T.רמות גבוהות של אלפא אקטינין ביום אפס וכדורואידים לבביים בני שלושה שבועות הצביעו על הרכב תאי קבוע וטהור מאוד במהלך התרבית. ביטוי מוגבר של גנים לבביים, דסמוזומים ומיטוכונדריה נצפה בספרואידים מאשר hiPSC-CMs שגודלו בדו-ממד במשך 90 יום. אחוז המכות של ספרואידים לבביים היה דומה בשלושת השבועות הראשונים שלאחר הדור וירד משמעותית בשבוע השישי עקב הידרדרות הספרואידים הלבביים.
שיעור המכות ירד משמעותית בשבוע השלישי לעומת השבוע השישי כתוצאה מהחמרה. פרמטרים חולפים של סידן הצביעו על ערך שיא גבוה יותר בשבוע השני, בעוד שזמן העלייה, זמן הדעיכה ומשך הזמן הארעי של הסידן ב-90% מהריקבון גדלו משמעותית בשבוע השלישי, מה שמראה כי ספרואידים שמקורם ב-hiPSC-CM היו אופטימליים מבחינה תפקודית בשבוע השני והשלישי שלאחר הדור. גודל הספרואיד גדל עם מספר התאים המשמשים לזריעה.
בממדים גדולים יותר, ספרואידים ישנים, המכות היו גבוהות משמעותית. שיעור מכות דומה וגבוה משמעותית הוצג על ידי ספרואידים 5k, 10k ו- 20k בהשוואה ל- 2.5k ספרואידים. שימור בהקפאה לא השפיע על כדאיות התאים בתוך כדורי הלב.
ביטוי דומה של חלבונים סרקומריים בספרואידים המופשרים והטריים תואמי גיל הצביע על יעילות הקפאה. לא היה שינוי משמעותי בקצב הפעימות של כדורי לב מופשרים או טריים. לא נצפו שינויים משמעותיים בזמן העלייה, בזמן הדעיכה וב-CTD90 של CS מופשר או טרי. לצד מידול מחלות ובדיקות סקר תרופתיות בעלות תפוקה גבוהה, ספרואידים אלה יכולים לשמש גם לביוריאקטורים של ייצור שלפוחית חוץ-תאית ולטיפולים חוץ-תאיים הקשורים לשלפוחית.
כמו כן, הביו-בנקאות של ספרואידים אלה יכולה לשמש כאספקת קרדיומיוציטים חדשה לאסטרטגיות רגנרטיביות. ראיות מצטברות מצביעות על כך שלביובנקים של מודלים של תאי גזע שמקורם בחולים עבור סיסטיק פיברוזיס, סרטן וספרואידים לבביים יש פוטנציאל גדול לפענוח מנגנונים מולקולריים לבדיקות סקר לתרופות ולרפואה מותאמת אישית.
