Ce protocole décrit un flux de travail pour la génération, la maintenance et l’analyse optique des sphéroïdes cardiaques. Ces sphéroïdes cardiaques sont essentiels pour combler les lacunes des modèles actuels de maladies in vitro. Cette technique permet aux chercheurs de créer un criblage et un stockage fonctionnel de nouvelle génération à haut débit des sphéroïdes cardiaques.
Commencez par ajouter un millilitre par centimètre carré de solution de décollement cardiaque stérile à chaque puits d’une plaque de culture contenant des cardiomyocytes pluripotents dérivés de cellules souches confluentes induites par l’homme. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Confirmer le détachement des cellules en observant des cellules blanches et rondes sous grossissement 4x d’un microscope à fond clair.
À l’aide d’une pipette de cinq millilitres, dissocier mécaniquement les cellules en les rinçant avec deux millilitres de milieu basal chaud pour préparer une suspension unicellulaire. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres et centrifuger pendant trois minutes à 300 g. Ensuite, aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de média de replaquage hiPSC-CM.
Utilisez un embout de pipette de 1 000 microlitres pour dissocier la pastille de cellule. Après trois ou quatre mélanges, lorsque la solution semble homogène, chargez-la dans une cassette pour compter les cellules et transférez la quantité appropriée de cellules dans 100 microlitres de milieu de placage à chaque puits d’une plaque de fixation ultra-basse, à fond rond, à 96 puits. Placez la plaque de sphéroïdes cardiaques sur un agitateur orbital dans l’incubateur à 70 tr / min avec une température de 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone, 21% d’oxygène et 90% d’humidité pendant 24 heures.
Pour éviter la rupture du sphéroïde, aspirez seulement 50 microlitres de milieu de chaque puits et ajoutez 100 microlitres de RPMI plus milieu B27 par puits pendant les 48 premières heures. Ensuite, aspirez 100 microlitres du milieu de chaque puits et ajoutez 100 microlitres du milieu de maturation par puits. Maintenez les cellules dans le milieu de maturation et rafraîchissez le milieu tous les deux à trois jours.
Placer la plaque sphéroïde sur de la glace pendant 10 minutes pour le prérefroidissement avant de centrifuger la plaque pendant trois minutes à 70g. Retirez le milieu jusqu’à ce qu’il reste 50 microlitres dans le puits. Ajoutez ensuite 200 microlitres de milieu de congélation hiPSC glacé par puits.
Scellez la plaque avec un film d’étanchéité de plaque. Pour préparer le moule en silicium, mélangez les composants du kit d’élastomère de silicium dans un rapport de 10 pour 1 et ajoutez la solution à l’intérieur de la partie inférieure de la plaque de puits. Débulez la solution à l’aide d’une pompe à vide pendant 15 à 20 minutes.
Placez le moule dans un four et durcissez-le à 60 degrés Celsius pendant huit heures pour obtenir un élastomère semi-flexible qui est décollé de la plaque. Placez soigneusement la plaque scellée dans un moule en silicone, assurant un échange de chaleur uniforme entre la plaque de puits et le congélateur. Congeler la plaque à 80 degrés Celsius pendant au moins quatre heures dans le moule en silicone préparé avant de transférer la plaque dans un réservoir d’azote liquide ou un congélateur à 150 degrés Celsius pour un stockage à long terme.
Pour assurer une décongélation rapide des sphéroïdes cardiaques, prélevez une plaque cellulaire avec des sphéroïdes cardiaques à la fois à partir de l’azote liquide et placez-la dans l’incubateur pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius, contenant 5% de dioxyde de carbone, 21% d’oxygène et 90% d’humidité. Retirez le film d’étanchéité de la plaque et aspirez 150 microlitres de chaque puits avant d’ajouter 200 microlitres d’un milieu basal chaud à chaque puits. Centrifuger la plaque à 70g pendant trois minutes, et répéter le lavage moyen basal chaud.
Une fois cela fait, retirez 150 microlitres du milieu et ajoutez 200 microlitres de milieu de décongélation des cardiomyocytes dans chaque puits. Répétez ensuite le lavage RPMI comme mentionné lors de la génération de sphéroïdes cardiaques, puis le maintien des cellules dans le milieu de maturation. Après une semaine de culture, les sphéroïdes cardiaques décongelés sont optimaux pour l’imagerie optique de manipulation du calcium.
Aspirer 150 microlitres de chaque puits. Traitez les sphéroïdes cardiaques décongelés avec 100 microlitres de milieu de colorant calcique Cal-520 AM par puits dans des conditions sombres et incuber la plaque pendant 60 minutes. Préparez un système d’acquisition et d’analyse du calcium en alimentant le microscope et en vous assurant que l’option de contrôle environnemental est activée.
Ajustez les dimensions de l’ouverture de la caméra et du cadrage pour réduire la zone d’arrière-plan. Pour mesurer le signal de calcium, à l’aide d’un laser de 488 nanomètres, réglez le contraste sur un fond noir avec un signal vert vif pendant la libération de calcium. Enregistrez une vidéo avec un flux constant de 2 à 10 pics en 10 secondes.
Enregistrez une vidéo de 10 secondes et balayez la plaque de 96 puits, en vous déplaçant d’abord vers la gauche, puis vers le bas en zigzag pour couvrir toute la plaque. Après avoir acquis les transitoires calciques, analysez les données à l’aide d’un logiciel d’analyse des traces de fluorescence. Les sphéroïdes cardiaques ont acquis une structure 3D dès le premier jour après l’ensemencement, qui pouvait être cultivée jusqu’à six semaines.
La majorité des sphéroïdes cardiaques âgés de trois semaines ont exprimé une organisation régulière du sarcomère avec l’alpha-actinine et la troponine T.Des niveaux élevés d’alpha-actinine chez les sphéroïdes cardiaques du jour zéro et de trois semaines ont indiqué une composition cellulaire constante et très pure pendant la culture. Une expression accrue des gènes cardiaques, des desmosomes et des mitochondries a été observée chez les sphéroïdes que chez les hiPSC-CM cultivés en 2D pendant 90 jours. Le pourcentage de battements de sphéroïdes cardiaques était similaire au cours des trois premières semaines post-génération et a diminué de manière significative au cours de la sixième semaine en raison de la détérioration des sphéroïdes cardiaques.
Le taux de battement a été significativement réduit à la troisième semaine par rapport et a diminué à la sixième semaine en raison de la détérioration. Les paramètres transitoires du calcium indiquaient une valeur maximale plus élevée à la deuxième semaine, tandis que le temps de montée, le temps de désintégration et la durée transitoire du calcium à 90% de la désintégration étaient significativement augmentés à la troisième semaine, montrant que les sphéroïdes dérivés de hiPSC-CM étaient fonctionnellement optimaux aux semaines deux et trois après la génération. La taille des sphéroïdes augmentait avec le nombre de cellules utilisées pour l’ensemencement.
Chez les vieux sphéroïdes de plus grande taille, les coups étaient significativement plus élevés. Un taux de battement similaire et significativement plus élevé a été montré par les sphéroïdes 5k, 10k et 20k par rapport aux sphéroïdes 2,5k. La cryoconservation n’a pas affecté la viabilité cellulaire dans les sphéroïdes cardiaques.
Une expression similaire des protéines sarcomériques dans les sphéroïdes décongelés et frais appariés à l’âge indiquait une efficacité de cryoconservation. Il n’y avait pas de changement significatif dans le taux de battement des sphéroïdes cardiaques décongelés ou frais. Aucun changement significatif n’a été observé dans le temps de montée, le temps de désintégration et le CTD90 du CS décongelé ou frais. Outre la modélisation de la maladie et les criblages de médicaments à haut débit, ces sphéroïdes peuvent également être utilisés pour les bioréacteurs de production de vésicules extracellulaires et les thérapies liées aux vésicules extracellulaires.
En outre, la biobanque de ces sphéroïdes peut être utilisée comme un nouvel approvisionnement en cardiomyocytes pour des stratégies de régénération. L’accumulation de preuves suggère que les biobanques de modèles de cellules souches dérivées de patients pour la fibrose kystique, le cancer et les sphéroïdes cardiaques ont un grand potentiel pour démêler les mécanismes moléculaires pour les dépistages de médicaments et pour la médecine personnalisée.
