Dieses Protokoll beschreibt einen Arbeitsablauf für die Erzeugung, Pflege und optische Analyse von kardialen Sphäroiden. Diese kardialen Sphäroide sind unerlässlich, um die Lücke in aktuellen In-vitro-Krankheitsmodellen zu schließen. Diese Technik ermöglicht es Forschern, Hochdurchsatz-Screening und funktionelle Speicherung von Herzsphäroiden der nächsten Generation zu entwickeln.
Beginnen Sie mit der Zugabe von einem Milliliter pro Quadratzentimeter steriler Herzablösungslösung zu jeder Vertiefung einer Kulturplatte, die konfluente, vom Menschen induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten enthält. Inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Bestätigen Sie die Ablösung der Zellen, indem Sie weiße und runde Zellen unter 4-facher Vergrößerung eines Hellfeldmikroskops beobachten.
Dissoziieren Sie die Zellen mit einer Fünf-Milliliter-Pipette mechanisch, indem Sie sie mit zwei Millilitern warmem Basalmedium spülen, um eine Einzelzellsuspension herzustellen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie drei Minuten lang bei 300 g. Dann saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter hiPSC-CM-Beschichtungsmedium.
Verwenden Sie eine 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze, um das Zellpellet zu dissoziieren. Laden Sie die Lösung nach drei oder vier Mischungen, wenn sie homogen erscheint, in eine Kassette, um die Zellen zu zählen, und übertragen Sie die entsprechende Menge an Zellen in 100 Mikrolitern Überzugsmedium in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz und rundem Boden. Legen Sie die kardiale Sphäroideplatte 24 Stunden lang bei 70 U/min bei einer Temperatur von 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid, 21 % Sauerstoff und 90 % Luftfeuchtigkeit auf einen Orbitalschüttler im Inkubator.
Um einen Sphäroidbruch zu vermeiden, saugen Sie nur 50 Mikroliter Medium aus jeder Vertiefung ab und fügen Sie in den ersten 48 Stunden 100 Mikroliter RPMI plus B27-Medium pro Vertiefung hinzu. Als nächstes saugen Sie 100 Mikroliter des Mediums aus jeder Vertiefung ab und fügen 100 Mikroliter des Reifungsmediums pro Vertiefung hinzu. Halten Sie die Zellen im Reifemedium und erfrischen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage.
Legen Sie die Sphäroidplatte zum Vorkühlen 10 Minuten lang auf Eis, bevor Sie die Platte drei Minuten lang bei 70 g zentrifugieren. Entfernen Sie das Medium, bis 50 Mikroliter im Brunnen verbleiben. Fügen Sie dann 200 Mikroliter eiskaltes hiPSC-Gefriermedium pro Vertiefung hinzu.
Versiegeln Sie die Platte mit einer Plattenschweißfolie. Um die Siliziumform vorzubereiten, mischen Sie die Komponenten des Siliziumelastomer-Kits in einem Verhältnis von 10 zu 1 und fügen Sie die Lösung in den unteren Teil der Well-Platte hinzu. Entblasen Sie die Lösung mit einer Vakuumpumpe für 15 bis 20 Minuten.
Legen Sie die Form in einen Ofen und härten Sie sie acht Stunden lang bei 60 Grad Celsius aus, um ein halbflexibles Elastomer zu erhalten, das von der Platte abgezogen wird. Legen Sie die versiegelte Platte vorsichtig in eine Silikonform, um einen gleichmäßigen Wärmeaustausch zwischen der Wellplatte und dem Gefrierschrank zu gewährleisten. Frieren Sie die Platte bei 80 Grad Celsius für mindestens vier Stunden in der vorbereiteten Silikonform ein, bevor Sie die Platte zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstofftank oder einen 150 Grad Celsius-Gefrierschrank überführen.
Um ein schnelles Auftauen der Herzsphäroide zu gewährleisten, sammeln Sie jeweils eine Zellplatte mit Herzsphäroiden aus dem flüssigen Stickstoff und legen Sie sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in den Inkubator mit 5% Kohlendioxid, 21% Sauerstoff und 90% Feuchtigkeit. Entfernen Sie die Versiegelungsfolie von der Platte und saugen Sie 150 Mikroliter jeder Vertiefung ab, bevor Sie 200 Mikroliter eines warmen Basalmediums in jede Vertiefung geben. Zentrifugieren Sie den Teller drei Minuten lang bei 70 g und wiederholen Sie die warme Grundwäsche.
Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie 150 Mikroliter des Mediums und fügen Sie 200 Mikroliter Kardiomyozyten-Auftaumedium in jede Vertiefung hinzu. Wiederholen Sie dann die RPMI-Wäsche wie erwähnt während der kardialen Sphäroidgenerierung, gefolgt von der Aufrechterhaltung der Zellen im Reifungsmedium. Nach einer Woche der Kultur sind die aufgetauten Herzsphäroide optimal für die optische Bildgebung mit Kalzium.
Saugen Sie 150 Mikroliter von jeder Vertiefung ab. Behandeln Sie die aufgetauten Herzsphäroide mit 100 Mikrolitern Cal-520 AM Calciumfarbstoff pro Vertiefung unter dunklen Bedingungen und inkubieren Sie die Platte 60 Minuten lang. Bereiten Sie ein Kalziumerfassungs- und -analysesystem vor, indem Sie das Mikroskop mit Strom versorgen und sicherstellen, dass die Umgebungskontrolloption aktiviert ist.
Passen Sie die Abmessungen der Kamera und der Blende an, um den Hintergrundbereich zu minimieren. Um das Kalziumsignal mit einem 488-Nanometer-Laser zu messen, stellen Sie den Kontrast während der Kalziumfreisetzung auf einen schwarzen Hintergrund mit einem hellgrünen Signal ein. Nehmen Sie innerhalb von 10 Sekunden ein Video mit einem konsistenten Strom von 2 bis 10 Spitzen auf.
Nehmen Sie ein 10-Sekunden-Video auf und scannen Sie über die 96-Well-Platte, wobei Sie sich zunächst nach links und dann im Zickzack nach unten bewegen, um die gesamte Platte abzudecken. Nachdem Sie die Kalziumtransienten erfasst haben, analysieren Sie die Daten mit einer Software zur Analyse von Fluoreszenzspuren. Die kardialen Sphäroide erhielten am ersten Tag nach der Aussaat eine 3D-Struktur, die bis zu sechs Wochen lang kultiviert werden konnte.
Die Mehrzahl der drei Wochen alten kardialen Sphäroide exprimierte eine reguläre Sarkomerorganisation mit Alpha-Actinin und Troponin T. Hohe Alpha-Actinin-Spiegel in den am Tag null und drei Wochen alten Herzsphäroiden deuteten auf eine konstante und hochreine Zellzusammensetzung während der Kultivierung hin. Eine erhöhte Expression der kardialen Gene, Desmosomen und Mitochondrien wurde in Sphäroiden beobachtet als in hiPSC-CMs, die 90 Tage lang in 2D kultiviert wurden. Der Schlagprozentsatz der Herzsphäroide war in den ersten drei Wochen nach der Generierung ähnlich und fiel in der sechsten Woche aufgrund der Verschlechterung der Herzsphäroide signifikant ab.
Die Schlagrate war in der dritten Woche im Vergleich signifikant reduziert und sank in der sechsten Woche als Folge der Verschlechterung. Die transienten Calciumparameter zeigten in der zweiten Woche einen höheren Spitzenwert an, während die Anstiegszeit, die Zerfallszeit und die transiente Calciumdauer bei 90% des Zerfalls in der dritten Woche signifikant erhöht waren, was zeigt, dass hiPSC-CM-abgeleitete Sphäroide in den Wochen zwei und drei nach der Generierung funktionell optimal waren. Die Sphäroidgröße nahm mit der Anzahl der Zellen zu, die für die Aussaat verwendet wurden.
Bei größeren, alten Sphäroiden war der Schlag deutlich höher. Eine ähnliche und signifikant höhere Schlagrate wurde von 5k-, 10k- und 20k-Sphäroiden im Vergleich zu 2,5k-Sphäroiden gezeigt. Die Kryokonservierung hatte keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen innerhalb der kardialen Sphäroide.
Eine ähnliche Expression von sarkomeren Proteinen in den aufgetauten und frischen, altersangepassten Sphäroiden deutete auf eine Kryokonservierungseffizienz hin. Es gab keine signifikante Veränderung in der Schlagrate von aufgetauten oder frischen Herzsphäroiden. Es wurden keine signifikanten Veränderungen in der Anstiegszeit, der Abklingzeit und dem CTD90 von aufgetautem oder frischem CS beobachtet. Neben der Modellierung von Krankheiten und Hochdurchsatz-Wirkstoffscreenings können diese Sphäroide auch für Bioreaktoren der extrazellulären Vesikelproduktion und extrazelluläre Vesikeltherapien eingesetzt werden.
Das Biobanking dieser Sphäroide kann auch als neuartige Kardiomyozytenversorgung für regenerative Strategien genutzt werden. Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass Biobanken von Stammzellmodellen von Patienten für Mukoviszidose, Krebs und kardiale Sphäroide ein großes Potenzial für die Entschlüsselung molekularer Mechanismen für Arzneimittelscreenings und für die personalisierte Medizin haben.
