Este protocolo descreve um fluxo de trabalho para a geração, manutenção e análise óptica de esferoides cardíacos. Esses esferoides cardíacos são essenciais para preencher a lacuna nos atuais modelos de doenças in vitro. Essa técnica permite que os pesquisadores criem triagem de próxima geração e alto rendimento e armazenamento funcional de esferoides cardíacos.
Comece com a adição de um mililitro por centímetro quadrado de solução de descolamento cardíaco estéril a cada poço de uma placa de cultura contendo cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos confluentes. Incubar a placa a 37 graus Celsius por 15 minutos. Confirme o descolamento das células observando células brancas e redondas sob ampliação de 4x de um microscópio de campo brilhante.
Usando uma pipeta de cinco mililitros, dissociar mecanicamente as células, lavando-as com dois mililitros de meio basal quente para preparar uma única suspensão celular. Transfira a suspensão da célula para um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugar por três minutos a 300g. Em seguida, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em um mililitro de meio de replating hiPSC-CM.
Use uma ponta de pipeta de 1.000 microlitros para dissociar a pastilha celular. Após três ou quatro misturas, à medida que a solução parecer homogênea, carregue-a em um para contar as células e transfira a quantidade apropriada de células em 100 microlitros de meio de replatagem para cada poço de uma placa de fixação ultrabaixa, de fundo redondo, de 96 poços. Coloque a placa de esferoides cardíacos em um agitador orbital na incubadora a 70 rpm com uma temperatura de 37 graus Celsius, dióxido de carbono a 5%, oxigênio a 21% e umidade de 90% por 24 horas.
Para evitar a ruptura esferoide, aspirar apenas 50 microlitros de meio de cada poço e adicionar 100 microlitros de RPMI mais B27 médio por poço durante as primeiras 48 horas. Em seguida, aspirar 100 microlitros do meio de cada poço e adicionar 100 microlitros do meio de maturação por poço. Mantenha as células no meio de maturação e atualize o meio a cada dois ou três dias.
Coloque a placa esferoide no gelo por 10 minutos para pré-resfriamento antes de centrifugar a placa por três minutos a 70g. Retire o meio até que 50 microlitros permaneçam no poço. Em seguida, adicione 200 microlitros de meio de congelamento hiPSC gelado por poço.
Sele a placa com uma película de vedação da placa. Para preparar o molde de silício, misture os componentes do kit de elastômero de silício em uma proporção de 10 para 1 e adicione a solução dentro da parte inferior da placa do poço. Desborhe a solução usando uma bomba de vácuo por 15 a 20 minutos.
Coloque o molde em um forno e cure-o a 60 graus Celsius por oito horas para obter um elastômero semi-flexível que é retirado da placa. Coloque a placa selada cuidadosamente em um molde de silicone, garantindo uma troca de calor uniforme entre a placa do poço e o freezer. Congele a placa a 80 graus Celsius por um mínimo de quatro horas no molde de silicone preparado antes de transferir a placa para um tanque de nitrogênio líquido ou um freezer de 150 graus Celsius para armazenamento a longo prazo.
Para garantir um rápido descongelamento dos esferoides cardíacos, colete uma placa celular com esferoides cardíacos de cada vez do nitrogênio líquido e coloque-a na incubadora por 15 minutos a 37 graus Celsius, com 5% de dióxido de carbono, 21% de oxigênio e 90% de umidade. Remova o filme de vedação da placa e aspirar 150 microlitros de cada poço antes de adicionar 200 microlitros de um meio basal quente a cada poço. Centrifugar a placa a 70g durante três minutos e repetir a lavagem basal a meio quente.
Uma vez feito, remova 150 microlitros do meio e adicione 200 microlitros de cardiomiócitos descongelando o meio em cada poço. Em seguida, repita a lavagem do RPMI como mencionado durante a geração esferoide cardíaca, seguida pela manutenção das células no meio de maturação. Após uma semana da cultura, os esferoides cardíacos descongelados são ideais para imagens ópticas de manipulação de cálcio.
Aspirar 150 microlitros de cada poço. Trate os esferoides cardíacos descongelados com 100 microlitros de meio de corante de cálcio Cal-520 AM por poço em condições escuras e incube a placa por 60 minutos. Prepare um sistema de aquisição e análise de cálcio alimentando o microscópio e garantindo que a opção de controle ambiental esteja ativada.
Ajuste as dimensões da câmera e da abertura do enquadramento para minimizar a área de fundo. Para medir o sinal de cálcio, usando um laser de 488 nanômetros, defina o contraste para um fundo preto com um sinal verde brilhante durante a liberação de cálcio. Grave um vídeo com um fluxo consistente de 2 a 10 picos em 10 segundos.
Grave um vídeo de 10 segundos e digitalize a placa de 96 poços, inicialmente movendo-se para a esquerda e, em seguida, para baixo em ziguezague para cobrir toda a placa. Após a aquisição dos transientes de cálcio, analise os dados utilizando um software de análise de traços de fluorescência. Os esferoides cardíacos adquiriram uma estrutura 3D no primeiro dia pós-semeadura, que pôde ser cultivada por até seis semanas.
A maioria dos esferoides cardíacos de três semanas de idade expressou organização regular do sarcômero com alfa actinina e troponina T.Altos níveis de alfa actinina no dia zero e esferoides cardíacos de três semanas de idade indicaram uma composição celular constante e altamente pura durante a cultura. Um aumento da expressão dos genes cardíacos, desmossomos e mitocôndrias foi observado em esferoides do que hiPSC-CMs cultivados em 2D por 90 dias. A porcentagem de batimento dos esferoides cardíacos foi semelhante nas primeiras três semanas pós-geração e caiu significativamente na sexta semana devido à deterioração dos esferoides cardíacos.
A taxa de batimento foi significativamente reduzida na terceira semana em comparação e caiu na sexta semana como resultado da deterioração. Os parâmetros transitórios de cálcio indicaram um valor de pico mais alto na segunda semana, enquanto o tempo de subida, o tempo de decaimento e a duração transitória do cálcio em 90% do decaimento foram significativamente aumentados na terceira semana, mostrando que os esferoides derivados de hiPSC-CM foram funcionalmente ótimos nas semanas dois e três pós-geração. O tamanho do esferoide aumentou com o número de células usadas para semeadura.
Em tamanho maior, esferoides antigos, a batida foi significativamente maior. Uma taxa de batimento semelhante e significativamente maior foi mostrada por esferoides de 5k, 10k e 20k em comparação com esferoides de 2,5k. A criopreservação não afetou a viabilidade celular dentro dos esferoides cardíacos.
Expressão semelhante de proteínas sarcômeras nos esferoides descongelados e frescos compatíveis com a idade indicou eficiência de criopreservação. Não houve alteração significativa na taxa de batimento de esferoides cardíacos descongelados ou frescos. Não foram observadas alterações significativas no tempo de subida, no tempo de decaimento e na CTD90 de CS descongelados ou frescos. Ao lado da modelagem de doenças e exames de drogas de alto rendimento, esses esferoides também podem ser usados para biorreatores de produção de vesículas extracelulares e terapias extracelulares relacionadas à vesícula.
Além disso, o biobanco desses esferoides pode ser usado como um novo suprimento de cardiomiócitos para estratégias regenerativas. Evidências acumuladas sugerem que os biobancos de modelos de células-tronco derivadas de pacientes para fibrose cística, câncer e esferoides cardíacos têm grande potencial para desvendar mecanismos moleculares para exames de drogas e para medicina personalizada.
