Этот протокол может быть использован для исследования многочисленных культур и предоставить новый инструмент для изучения прямой клеточной коммуникации. Это новое устройство значительно экономит время при создании модели культуры и применимо к различным типам клеток, требующих или не требующих специального покрытия. Действительно, четыре отсека вставок, напечатанных на 3D-принтере, позволяют культивировать различные типы клеток в монослое или в 3D одним и тем же способом с различными комбинациями.
Напечатанные на 3D-принтере вставки более прочны, гибки, масштабируемы и могут быть использованы для создания экспериментальных моделей для изучения физиопатологий, таких как иммунология или андрогенез. Для начала смешайте два компонента, пищевой силикон и катализатор, входящие в комплект, в пропорции 10:1 с помощью шпателя, стерилизованного 70% этанолом, в соответствии с инструкциями производителя. Нанесите вставки на силиконовую смесь пинцетом так, чтобы смесь равномерно распределилась по нижнему краю вкладыша.
Поместите вставки в лунки шестилуночного планшета и слегка надавите, чтобы убедиться, что вставки находятся в тесном контакте с планшетом, чтобы избежать утечки среды для клеточной культуры. Поставьте пластину при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы поддерживать процесс затвердевания кремния в течение одного часа. После застывания простерилизуйте пластины со вкладышами, погрузив их в ванну с 70%-ным этанолом на срок от 30 минут до одного часа.
Затем слейте спирт с помощью пипетки и дайте планшету высохнуть в течение ночи в колпаке для клеточных культур. Для культивирования кератиноцитов наружной оболочки корня и дермальных микрососудистых эндотелиальных клеток человека необходимо выбросить среду из колб и добавить пять миллилитров трипсина, чтобы отделить клетки. Поместите колбу, содержащую кератиноциты наружной оболочки корня, при температуре 37 градусов Цельсия с 5%-ным углекислым газом в течение пяти минут и инкубируйте колбу, содержащую дермальные микрососудистые эндотелиальные клетки человека, в течение пяти минут при комнатной температуре.
В стерильной конической пробирке объемом 15 миллилитров смешать раствор трипсина, содержащий кератиноциты наружной оболочки корня, с пятью миллилитрами среды мезенхимальных стволовых клеток, дополненной 5% FBS и факторами роста, и клетки микрососудистого эндотелия человека с пятью миллилитрами среды эндотелиальных клеток с добавлением 5% FBS и факторов роста. Центрифугируют кератиноциты наружной оболочки корня и суспензии микрососудистых эндотелиальных клеток человека при 200 G в течение пяти минут при комнатной температуре. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте клетки в двух миллилитрах соответствующих сред.
Смешайте 10 микролитров клеточной суспензии с 10 микролитрами красителя трипанового синего и добавьте 10 микролитров смеси в камеру счетного предметного стекла. Вставьте ползунок для подсчета клеток в систему подсчета клеток и определите количество клеток и их жизнеспособность. После приготовления клеточной суспензии в концентрации 50 000 клеток на миллилитр в соответствующей среде распределите пипеткой 800 микролитров на один миллилитр клеточной суспензии на отдельные большие отсеки и от 100 до 150 микролитров на отдельные мелкие отсеки.
Кератиноциты в среде мезенхимальных стволовых клеток, дополненные 5%ФБС и факторами роста, и дермальные микрососудистые эндотелиальные клетки человека в эндотелиальной клеточной среде, дополненные 5%ФБС и факторами роста в малых и других больших компартментах. Поместите планшет с клеточной культурой при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа или в обычных условиях, чтобы обеспечить адгезию и/или созревание клеток. Опорожните питательные среды из различных отсеков вкладышей с помощью пипетки.
Затем промойте клетки одним миллилитром теплого PBS при температуре 37 градусов Цельсия в больших отсеках и 200 микролитрами в маленьких отсеках. Добавьте три миллилитра общей среды, подобранной так, чтобы она была совместима со всеми типами клеток. Поместите планшет с кокультурами при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом на 24–48 часов.
Отделите клетки с помощью трипсина для подсчета клеточной суспензии и проверьте жизнеспособность с помощью окрашивания трипановым синим. После наблюдения за морфологией подсчитайте количество клеток различных компартментов во время эксперимента под оптическим микроскопом через 24-48 часов инкубации. Во-первых, в конце эксперимента легким поворотом снимите вставки с шестилуночной пластины, а затем снимите кремний со вставок, потянув за него.
Вымойте вкладыши обычными моющими средствами для клеточных культур и чистящими средствами. Затем простерилизуйте вкладыши для дальнейшего использования в автоклаве или погрузив их в ванну с 70%-ным этанолом на один час. Сравнивали фенотип и жизнеспособность клеток, где 90%-ная жизнеспособность наблюдалась в лунках шестилуночных планшетов, а 91%-ная – в напечатанных на 3D-принтере вставках для кератиноцитов наружной оболочки корня.
Жизнеспособность дермальных микрососудистых эндотелиальных клеток человека составила 85% в лунках шестилуночной пластины, в то время как 86% в 3D-печатных вкладышах. Непрямые клеточные коммуникации между кератиноцитами и эндотелиальными клетками в 3D-печатных вставках показали, что в присутствии кератиноцитов во вставках пролиферация микрососудистых эндотелиальных клеток кожи человека достоверно увеличивалась в 1,5 раза через 24 часа и в 3,1 раза через 48 часов по сравнению с контролем. Однако показано, что кератиноцит среды состояния наружной оболочки корня значительно увеличивает пролиферацию микрососудистых эндотелиальных клеток кожи человека в 1,5 раза через 24 часа и в 2,1 раза через 48 часов.
Напечатанная на 3D-принтере модель вставки была протестирована для определения влияния кератиноцитов на миграцию микрососудистых эндотелиальных клеток кожи человека. В контрольной группе эндотелиальные клетки мигрировали и покрывали примерно 44% площади раны через 24 часа. В присутствии кератиноцитов наблюдалось значительное увеличение миграции микрососудистых эндотелиальных клеток человека в дермальную среду, что свидетельствует о том, что через три, 12 и 24 часа площадь раны покрывалась на 43%, 67% и 99% соответственно.
Аналогичным образом, миграция HDMEC увеличивается в присутствии кератиноцитов среды состояния наружной оболочки корня. Крайне важно обеспечить герметичность вкладыша к пластине, чтобы предотвратить утечку среды ячеек из одного отсека в другой. Может быть сделано несколько применений, таких как пролиферация, миграция, седативное образование, анализы ДНК, РНК, белков и другие анализы.
