פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר מחקרי תרבית רבים ולספק כלי חדש לחקר תקשורת סלולרית ישירה. התקן חדש זה חוסך זמן משמעותי בהקמת מודל תרבית והוא ישים לסוגי תאים שונים הדורשים ציפוי ספציפי או לא. ואכן, ארבעת התאים של התוספות המודפסות בתלת-ממד, מאפשרים לגדל סוגי תאים שונים בחד-שכבתיים, או בתלת-ממד באותו אופן עם שילובים שונים.
התוספות המודפסות בתלת-ממד עמידות יותר, גמישות, ניתנות להרחבה, וניתן להשתמש בהן לתכנון מודלים ניסיוניים לחקר הפיזיופתולוגיות, כגון אימונולוגיה או אנדרוגנזה. כדי להתחיל, ערבבו את שני הרכיבים, סיליקון מזון וזרז המסופקים בערכה ביחס של 10:1, באמצעות מרית מעוקרת אתנול 70% בהתאם להוראות היצרן. מרחו את התוספות על תערובת הסיליקון בפינצטה כך שהתערובת תפוזר בצורה הומוגנית בקצה התחתון של התוספת.
הניחו את התוספות בבארות של צלחת שש בארות והפעילו לחץ עדין כדי להבטיח שהתוספות נמצאות במגע הדוק עם הצלחת כדי למנוע דליפה של מדיום תרבית התא. מניחים את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס כדי לתמוך בתהליך ההתמצקות של הסיליקון למשך שעה אחת. לאחר המיצוק, מעקרים את הצלחות עם התוספות על ידי טבילתם באמבט אתנול 70% למשך 30 דקות עד שעה.
לאחר מכן, השליכו את האלכוהול על ידי פיפטינג, ותנו לצלחת להתייבש למשך הלילה במכסה מנוע של תרבית תאים. כדי לתרבית את הקרטינוציטים של מעטפת השורש החיצוני ותאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עוריים אנושיים, השליכו את התווך מהצלוחיות והוסיפו חמישה מיליליטר טריפסין כדי לנתק את התאים. מניחים את הבקבוק המכיל את הקרטינוציטים של מעטפת השורש החיצוני בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך חמש דקות, ודגרים על הבקבוק המכיל את תאי האנדותל המיקרו-וסקולריים העוריים האנושיים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
בצינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר, ערבבו את תמיסת הטריפסין המכילה את הקרטינוציטים של מעטפת השורש החיצוני עם חמישה מיליליטר של תווך תאי גזע מזנכימליים בתוספת 5% FBS וגורמי גדילה ותאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עוריים אנושיים עם חמישה מיליליטר של תווך תאי אנדותל בתוספת 5% FBS וגורמי גדילה. צנטריפוגות הקרטינוציטים של מעטפת השורש החיצוני ותרחיפים של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עוריים אנושיים ב -200 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת supernatant, להשעות מחדש את התאים בשני מיליליטר של המדיומים שלהם.
מערבבים 10 מיקרוליטר של תרחיף התא עם 10 מיקרוליטר של צבע כחול טריפאן, ומוסיפים 10 מיקרוליטר של התערובת לתוך התא של שקופית הספירה. הכנס את שקופית הספירה למערכת ספירת התאים וזהה את מספר התא ואת הכדאיות. לאחר הכנת תרחיף התא בריכוז של 50, 000 תאים למיליליטר בתווך המתאים, להפיץ 800 מיקרוליטר למיליליטר אחד של תרחיף התא לתוך תאים גדולים בודדים, ו 100 עד 150 מיקרוליטר לתוך תאים קטנים בודדים עם פיפטה.
ראו את הקרטינוציטים בתווך תאי גזע מזנכימליים בתוספת 5% FBS וגורמי גדילה ותאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עוריים אנושיים בתווך תאי אנדותל, בתוספת 5% FBS וגורמי גדילה בתאים קטנים וגדולים אחרים. הניחו את צלחת תרבית התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני, או בתנאים הרגילים, כדי לאפשר היצמדות או הבשלה של התא. רוקנו את אמצעי התרבות מהתאים השונים של התוספות באמצעות פיפטה.
לאחר מכן שטפו את התאים עם מיליליטר אחד של PBS חם 37 מעלות צלזיוס בתאים הגדולים, ו -200 מיקרוליטר בתאים הקטנים. הוסף שלושה מיליליטר של מדיום משותף שנבחר כך שיהיה תואם לכל סוגי התאים. הניחו את הצלחת המכילה את התרביות המשותפות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך 24 עד 48 שעות.
נתקו את התאים באמצעות טריפסין לספירת תרחיף תאים, ובדקו את הכדאיות באמצעות צביעה כחולה של טריפאן. לאחר התבוננות במורפולוגיה, ספרו את מספר התאים של התאים השונים במהלך הניסוי תחת מיקרוסקופ אופטי לאחר 24 עד 48 שעות של דגירה. ראשית, הסר את התוספות מצלחת שש הבארות בסוף הניסוי על ידי סיבוב קל, ולאחר מכן הסר את הסיליקון מהתוספות על ידי משיכתו.
שטפו את התוספות עם חומרי ניקוי קונבנציונליים לתרבית תאים וחומרי ניקוי. לאחר מכן לעקר את התוספות לשימוש עתידי autoclave, או על ידי טבילתם באמבט אתנול 70% למשך שעה אחת. הפנוטיפ ויכולת הקיום של התא הושוו, כאשר נצפתה כדאיות של 90% בבארות של ששת לוחות הבארות, וב-91% נצפתה בתוספות המודפסות בתלת-ממד עבור קרטינוציטים של מעטפת השורש החיצוני.
הכדאיות של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עוריים אנושיים הייתה 85% בבארות של צלחת שש הקידוחים, בעוד 86% בתוספות שהודפסו בתלת-ממד. התקשורת התאית העקיפה בין קרטינוציטים לתאי אנדותל בתוספות שהודפסו בתלת-ממד הראתה כי בנוכחות קרטינוציטים באינווסטים, התרבות תאי האנדותל המיקרו-וסקולריים העוריים האנושיים גדלה משמעותית פי 1.5 לאחר 24 שעות, ופי 3.1 לאחר 48 שעות בהשוואה לקבוצת הביקורת. עם זאת, קרטינוציטים של מדיום מצב מעטפת השורש החיצוני הוכח כמגביר באופן משמעותי את התפשטות תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עוריים אנושיים פי 1.5 לאחר 24 שעות, ופי 2.1 לאחר 48 שעות.
מודל תרבית ההוספה המודפסת בתלת-ממד נבדק כדי לקבוע את ההשפעה של קרטינוציטים על נדידת תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עוריים אנושיים. במצב הביקורת, תאי אנדותל נדדו וכיסו כ-44% משטח הפצע לאחר 24 שעות. בנוכחות קרטינוציטים, נצפתה עלייה משמעותית בנדידת תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים עוריים אנושיים, מה שמראה כי 43%67% ו-99% מאזור הפצע כוסו לאחר שלוש, 12 ו-24 שעות בהתאמה.
באופן דומה, ההגירה של HDMECs עולה בנוכחות קרטינוציטים של מדיום מצב נדן השורש החיצוני. חשוב להקפיד על איטום האינסרט לצלחת, על מנת למנוע זליגה של תווך התאים מתא אחד למשנהו. ניתן לבצע מספר יישומים, כגון התפשטות, הגירה, בדיקות היווצרות הרגעה DNA, RNA, חלבונים ואנליזות אחרות.
