Este protocolo pode ser usado para investigar numerosos estudos de cultura e fornecer uma nova ferramenta para investigar a comunicação celular direta. Este novo dispositivo economiza tempo significativo no estabelecimento de um modelo de cultura e é aplicável a diferentes tipos de células que requerem um revestimento específico ou não. De fato, os quatro compartimentos das inserções impressas em 3D permitem cultivar diferentes tipos de células em monocamada, ou em 3D da mesma forma com diferentes combinações.
As pastilhas impressas em 3D são mais duráveis, flexíveis, escaláveis e podem ser usadas para projetar modelos experimentais para estudos de fisiopatologias, como imunologia ou androgênese. Para começar, misture os dois componentes, silício alimentar e catalisador fornecidos no kit na proporção de 10:1, usando uma espátula esterilizada a etanol 70% de acordo com as instruções do fabricante. Aplique as pastilhas sobre a mistura de silicone com uma pinça para que a mistura seja distribuída homogeneamente na borda inferior da pastilha.
Coloque as pastilhas nos orifícios de uma placa de seis poços e aplique uma pressão suave para garantir que as pastilhas estejam em contato próximo com a placa para evitar qualquer vazamento do meio de cultura celular. Coloque a placa a 37 graus Celsius para apoiar o processo de solidificação do silício por uma hora. Após a solidificação, esterilizar as placas com as pastilhas, imergindo-as em banho de etanol 70% por 30 minutos a uma hora.
Em seguida, descarte o álcool por pipetagem e deixe a placa secar durante a noite em uma capa de cultura celular. Para cultivar os queratinócitos da bainha radicular externa e as células endoteliais microvasculares dérmicas humanas, descartar o meio dos frascos e adicionar cinco mililitros de tripsina para desprender as células. Colocar o balão contendo os queratinócitos da bainha radicular externa a 37 graus Celsius com dióxido de carbono a 5% durante cinco minutos e incubar o balão contendo as células endoteliais microvasculares humanas dérmicas durante cinco minutos à temperatura ambiente.
Em um tubo cônico estéril de 15 mililitros, misturar a solução de tripsina contendo os queratinócitos da bainha radicular externa com cinco mililitros de meio de células-tronco mesenquimais suplementado com 5% de SFB e fatores de crescimento e as células endoteliais microvasculares humanas com cinco mililitros de meio de células endoteliais suplementadas com 5% de SFB e fatores de crescimento. Centrifugar os queratinócitos da bainha radicular externa e as suspensões de células endoteliais microvasculares dérmicas humanas a 200 G por cinco minutos à temperatura ambiente. Após descartar o sobrenadante, ressuspender as células em dois mililitros de seus respectivos meios.
Misture 10 microlitros da suspensão celular com 10 microlitros de corante azul de tripano e adicione 10 microlitros da mistura na câmara da lâmina de contagem. Insira a lâmina de contagem no sistema de contagem de células e detecte o número e a viabilidade da célula. Depois de preparar a suspensão celular a uma concentração de 50.000 células por mililitro no respectivo meio, distribua 800 microlitros a um mililitro da suspensão celular nos grandes compartimentos individuais e 100 a 150 microlitros nos pequenos compartimentos individuais com uma pipeta.
Veja os queratinócitos em meio de células-tronco mesenquimais suplementado com 5% FBS e fatores de crescimento e células endoteliais microvasculares humanas dérmicas em meio de células endoteliais, suplementado com 5% FBS e fatores de crescimento nos pequenos e outros grandes compartimentos. Colocar a placa de cultura celular a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono, ou nas condições usuais, para permitir a adesão e/ou maturação celular. Esvazie os meios de cultura dos diferentes compartimentos das pastilhas usando uma pipeta.
Em seguida, lave as células com um mililitro de PBS quente de 37 graus Celsius nos grandes compartimentos e 200 microlitros nos pequenos compartimentos. Adicione três mililitros de um meio comum selecionado para ser compatível com todos os tipos de células. Colocar a placa contendo as co-culturas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono durante 24 a 48 horas.
Separar as células usando tripsina para contagem de suspensão celular e verificar a viabilidade usando a coloração de azul de tripano. Após a observação da morfologia, conte o número de células dos diferentes compartimentos durante o experimento em microscópio óptico após 24 a 48 horas de incubação. Primeiro, remova as pastilhas da placa de seis poços no final do experimento por uma leve torção e, em seguida, remova o silício das pastilhas puxando-o.
Lave as pastilhas com detergentes convencionais para cultura de células e materiais de limpeza. Em seguida, esterilize as pastilhas para uso futuro em autoclave ou mergulhando-as em banho de etanol 70% por uma hora. O fenótipo e a viabilidade celular foram comparados, onde 90% de viabilidade foi observada nos poços das placas dos seis poços, e a 91% foi observada nas pastilhas impressas em 3D para queratinócitos da bainha radicular externa.
A viabilidade das células endoteliais microvasculares dérmicas humanas foi de 85% nos poços da placa de seis poços, enquanto 86% nas pastilhas impressas em 3D. As comunicações celulares indiretas entre queratinócitos e células endoteliais nas inserções impressas em 3D demonstraram que, na presença de queratinócitos nas inserções, a proliferação das células endoteliais microvasculares humanas aumentou significativamente em 1,5 vezes após 24 horas e em 3,1 vezes após 48 horas em comparação com o controle. No entanto, demonstrou-se que o queratinócito do meio de condição da bainha radicular externa aumenta significativamente a proliferação de células endoteliais microvasculares dérmicas humanas em 1,5 vezes após 24 horas e em 2,1 vezes após 48 horas.
O modelo de co-cultura de pastilhas impressas em 3D foi testado para determinar o efeito dos queratinócitos na migração de células endoteliais microvasculares dérmicas humanas. Na condição controle, as células endoteliais migraram e cobriram aproximadamente 44% da área da ferida após 24 horas. Na presença de queratinócitos, observou-se um aumento significativo na migração de células endoteliais microvasculares dérmicas humanas, o que mostra que 43%67% e 99% da área da ferida foi coberta após três, 12 e 24 horas, respectivamente.
Da mesma forma, a migração de HDMECs aumenta na presença de queratinócitos do meio de condição da bainha radicular externa. É fundamental garantir a vedação da pastilha à placa, a fim de evitar o vazamento do meio de células de um compartimento para outro. Diversas aplicações podem ser feitas, como proliferação, migração, ensaios de formação de sedativos de DNA, RNA, proteína e outras análises.
