Questo protocollo può essere utilizzato per indagare su numerosi studi di coltura e fornire un nuovo strumento per studiare la comunicazione cellulare diretta. Questo nuovo dispositivo consente di risparmiare molto tempo nella creazione di un modello di coltura ed è applicabile a diversi tipi di cellule che richiedono o meno un rivestimento specifico. Infatti, i quattro scomparti degli inserti stampati in 3D, permettono di coltivare diversi tipi di cellule in monostrato, o in 3D allo stesso modo con diverse combinazioni.
Gli inserti stampati in 3D sono più durevoli, flessibili, scalabili e possono essere utilizzati per progettare modelli sperimentali per lo studio di fisiopatologie, come l'immunologia o l'androgenesi. Per iniziare, miscelare i due componenti, silicio alimentare e catalizzatore forniti nel kit in un rapporto di 10:1, utilizzando una spatola sterilizzata con etanolo al 70% secondo le istruzioni del produttore. Applicare gli inserti sulla miscela di silicone con una pinzetta in modo che la miscela sia distribuita in modo omogeneo sul bordo inferiore dell'inserto.
Posizionare gli inserti nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti e applicare una leggera pressione per assicurarsi che gli inserti siano a stretto contatto con la piastra per evitare perdite del terreno di coltura cellulare. Metti la piastra a 37 gradi Celsius per sostenere il processo di solidificazione del silicio per un'ora. Dopo la solidificazione, sterilizzare le piastre con gli inserti immergendole in un bagno di etanolo al 70% per 30 minuti a un'ora.
Successivamente, scartare l'alcol mediante pipettaggio e lasciare asciugare la piastra per una notte in una cappa per colture cellulari. Per coltivare i cheratinociti della guaina esterna della radice e le cellule endoteliali microvascolari cutanee umane, scartare il terreno dai palloni e aggiungere cinque millilitri di tripsina per staccare le cellule. Posizionare il pallone contenente i cheratinociti della guaina esterna della radice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per cinque minuti e incubare il pallone contenente le cellule endoteliali microvascolari cutanee umane per cinque minuti a temperatura ambiente.
In una provetta conica sterile da 15 millilitri, mescolare la soluzione di tripsina contenente i cheratinociti della guaina esterna della radice con cinque millilitri di terreno di cellule staminali mesenchimali integrato con il 5% di FBS e fattori di crescita e le cellule endoteliali microvascolari dermiche umane con cinque millilitri di mezzo di cellule endoteliali integrate con il 5% di FBS e fattori di crescita. Centrifugare i cheratinociti della guaina radicolare esterna e le sospensioni di cellule endoteliali microvascolari cutanee umane a 200 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere le cellule in due millilitri dei rispettivi substrati.
Mescolare 10 microlitri di sospensione cellulare con 10 microlitri di colorante blu tripano e aggiungere 10 microlitri di miscela nella camera del vetrino di conteggio. Inserire il vetrino di conteggio nel sistema di conteggio delle cellule e rilevare il numero di celle e la vitalità. Dopo aver preparato la sospensione cellulare a una concentrazione di 50.000 cellule per millilitro nel rispettivo mezzo, distribuire 800 microlitri a un millilitro di sospensione cellulare nei singoli grandi compartimenti e da 100 a 150 microlitri nei singoli piccoli compartimenti con una pipetta.
Vedi i cheratinociti in terreno di cellule staminali mesenchimali integrati con il 5% di FBS e fattori di crescita e le cellule endoteliali microvascolari dermiche umane in mezzo di cellule endoteliali, integrate con il 5% di FBS e fattori di crescita nei piccoli e altri grandi compartimenti. Posizionare la piastra di coltura cellulare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica, o nelle condizioni abituali, per consentire l'adesione e/o la maturazione cellulare. Svuotare i terreni di coltura dai diversi scomparti degli inserti utilizzando una pipetta.
Quindi sciacquare le celle con un millilitro di PBS caldo a 37 gradi Celsius negli scomparti grandi e 200 microlitri negli scomparti piccoli. Aggiungere tre millilitri di un terreno comune selezionato per essere compatibile con tutti i tipi di cellule. Posizionare la piastra contenente le cocolture a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 24-48 ore.
Staccare le cellule utilizzando la tripsina per il conteggio delle sospensioni cellulari e controllare la vitalità utilizzando la colorazione blu tripano. Dopo aver osservato la morfologia, contare il numero di cellule dei diversi compartimenti durante l'esperimento al microscopio ottico dopo 24-48 ore di incubazione. Innanzitutto, rimuovere gli inserti dalla piastra a sei pozzetti alla fine dell'esperimento ruotando leggermente, quindi rimuovere il silicone dagli inserti tirandolo.
Lavare gli inserti con detergenti convenzionali per colture cellulari e materiali per la pulizia. Quindi sterilizzare gli inserti per un uso futuro in autoclave o immergendoli in un bagno di etanolo al 70% per un'ora. Sono stati confrontati il fenotipo e la vitalità cellulare, dove è stata osservata una vitalità del 90% nei pozzetti delle piastre a sei pozzetti e del 91% negli inserti stampati in 3D per i cheratinociti della guaina esterna della radice.
La vitalità delle cellule endoteliali microvascolari dermiche umane era dell'85% nei pozzetti della piastra a sei pozzetti, mentre l'86% negli inserti stampati in 3D. Le comunicazioni cellulari indirette tra cheratinociti e cellule endoteliali negli inserti stampati in 3D hanno dimostrato che in presenza di cheratinociti negli inserti la proliferazione delle cellule endoteliali microvascolari cutanee umane è aumentata significativamente di 1,5 volte dopo 24 ore e di 3,1 volte dopo 48 ore rispetto al controllo. Tuttavia, è stato dimostrato che il cheratinocita del mezzo di condizione della guaina della radice esterna aumenta significativamente la proliferazione delle cellule endoteliali microvascolari cutanee umane di 1,5 volte dopo 24 ore e di 2,1 volte dopo 48 ore.
Il modello di co-coltura dell'inserto stampato in 3D è stato testato per determinare l'effetto dei cheratinociti sulla migrazione delle cellule endoteliali microvascolari cutanee umane. Nella condizione di controllo, le cellule endoteliali sono migrate e hanno coperto circa il 44% dell'area della ferita dopo 24 ore. In presenza di cheratinociti, è stato osservato un aumento significativo della migrazione delle cellule endoteliali microvascolari cutanee umane, che mostra che il 43% 67% e il 99% dell'area della ferita era coperta rispettivamente dopo tre, 12 e 24 ore.
Allo stesso modo, la migrazione degli HDMEC aumenta in presenza di cheratinociti del mezzo di condizione della guaina radicolare esterna. È fondamentale garantire la tenuta dell'inserto alla piastra, al fine di evitare la fuoriuscita del mezzo di celle da un compartimento all'altro. Diverse applicazioni potrebbero essere fatte, come la proliferazione, la migrazione, i saggi di formazione di sedativi DNA, RNA, proteine e altre analisi.
