创新的 3D 打印插入物，旨在实现简单的 2D 和 3D 细胞培养

该协议可用于研究许多培养研究，并为研究直接细胞通讯提供新工具。这种新设备节省了建立培养模型的大量时间，并且适用于是否需要特定涂层的不同细胞类型。事实上，3D打印插入物的四个隔室允许以单层或以相同的方式以不同的组合培养不同的细胞类型。

3D打印的插入物更耐用，灵活，可扩展，可用于设计生理病理学研究的实验模型，例如免疫学或雄激素生成。首先，根据制造商的说明，使用70%乙醇灭菌刮刀，以10：1的比例混合试剂盒中提供的两种成分，食品硅和催化剂。用镊子将嵌件涂在硅胶混合物上，使混合物均匀分布在嵌件的底部边缘。

将插入物放入六孔板的孔中并施加温和的压力，以确保插入物与板紧密接触，以避免细胞培养基泄漏。将板置于37摄氏度以支持硅的凝固过程一小时。凝固后，将板浸入70%乙醇浴中30分钟至1小时，用插入物对板进行灭菌。

接下来，通过移液丢弃酒精，让板在细胞培养罩中干燥过夜。为了培养外根鞘和人真皮微血管内皮细胞的角质形成细胞，从烧瓶中弃去培养基并加入五毫升胰蛋白酶以分离细胞。将装有外根鞘角质形成细胞的烧瓶与5%二氧化碳一起置于37摄氏度下5分钟，并将含有人真皮微血管内皮细胞的烧瓶在室温下孵育5分钟。

在15毫升无菌锥形管中，将含有外根鞘角质形成细胞的胰蛋白酶溶液与补充有5%FBS和生长因子的5毫升间充质干细胞培养基混合，将人真皮微血管内皮细胞与补充有5%FBS和生长因子的5毫升内皮细胞培养基混合。在室温下以200G离心外根鞘和人真皮微血管内皮细胞悬浮液的角质形成细胞5分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于两毫升各自的培养基中。

将10微升细胞悬液与10微升台盼蓝染料混合，并将10微升混合物加入计数载玻片的腔室中。将计数玻片插入细胞计数系统并检测细胞数量和活力。在相应培养基中以每毫升50， 000个细胞的浓度制备细胞悬液后，用移液管将800微升至1毫升的细胞悬液分配到各个大隔室中，并将100至150微升分配到各个小隔室中。

参见补充有5%FBS和生长因子的间充质干细胞培养基中的角质形成细胞以及内皮细胞培养基中的人真皮微血管内皮细胞，在小区室和其他大隔室中补充5%FBS和生长因子。将细胞培养板置于37摄氏度和5%二氧化碳下，或在通常条件下，以使细胞粘附和/或成熟。使用移液管清空插入物不同隔室的培养基。

然后在大隔室中用一毫升37摄氏度的温PBS冲洗细胞，在小隔室中用200微升冲洗细胞。加入三毫升选定适用于所有细胞类型的常用培养基。将含有共培养物的板置于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下 24 至 48 小时。

使用胰蛋白酶分离细胞进行细胞悬液计数，并使用台盼蓝染色检查活力。观察形态后，在孵育24至48小时后，在光学显微镜下计算实验期间不同隔室的细胞数。首先，在实验结束时通过轻微扭转从六孔板上取出插入物，然后通过将其拉下从插入物中取出硅。

用常规细胞培养洗涤剂和清洁材料清洗插入物。然后将插入物消毒以备将来在高压灭菌器中使用，或将它们浸入70%乙醇浴中一小时。比较表型和细胞活力，在六个孔板的孔中观察到90%的活力，在外根鞘角质形成细胞的3D打印插入物中观察到91%的活力。

在六孔板的孔中，人真皮微血管内皮细胞的活力为85%，而在3D打印插入物中为86%。3D打印插入物中角质形成细胞和内皮细胞之间的间接细胞通讯表明，在插入物中存在角质形成细胞的情况下，与对照组相比，人真皮微血管内皮细胞的增殖在24小时后显着增加1.5倍，48小时后显着增加3.1倍。然而，外根鞘条件培养基的角质形成细胞在24小时后显着增加人真皮微血管内皮细胞增殖1.5倍，48小时后增加2.1倍。

测试了3D打印插入物共培养模型，以确定角质形成细胞对人真皮微血管内皮细胞迁移的影响。在对照条件下，内皮细胞迁移并在24小时后覆盖约44%的伤口区域。在角质形成细胞存在的情况下，观察到人真皮微血管内皮细胞迁移显着增加，这表明分别在3,12和24小时后覆盖了43%67%和99%的伤口区域。

同样，HDMEC的迁移在外根鞘条件培养基的角质形成细胞的存在下增加。确保插入物密封到板上至关重要，以防止细胞培养基从一个隔室泄漏到另一个隔室。可以进行多种应用，例如增殖，迁移，镇静剂形成测定DNA，RNA，蛋白质和其他分析。