이 프로토콜은 수많은 배양 연구를 조사하고 직접 세포 통신을 조사하는 새로운 도구를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 이 새로운 장치는 배양 모델을 설정하는 데 상당한 시간을 절약하고 특정 코팅이 필요하거나 필요하지 않은 다양한 세포 유형에 적용할 수 있습니다. 실제로 3D 프린팅 인서트의 4개 구획을 통해 다양한 세포 유형을 단층으로 배양하거나 동일한 방식으로 다양한 조합으로 3D로 배양할 수 있습니다.
3D 프린팅 인서트는 내구성, 유연성, 확장성이 뛰어나며 면역학 또는 안드로제네시스와 같은 생리병리학 연구를 위한 실험 모델을 설계하는 데 사용할 수 있습니다. 시작하려면 제조업체의 지침에 따라 70% 에탄올 멸균 주걱을 사용하여 키트에 제공된 두 가지 구성 요소인 식품 실리콘 및 촉매를 10:1의 비율로 혼합합니다. 핀셋으로 실리콘 혼합물에 인서트를 도포하여 혼합물이 인서트의 하단 가장자리에 균일하게 분포되도록 합니다.
삽입물을 6웰 플레이트의 웰에 넣고 삽입물이 플레이트와 밀접하게 접촉되도록 부드러운 압력을 가하여 세포 배양 배지의 누출을 방지합니다. 플레이트를 섭씨 37도에 두어 실리콘의 응고 과정을 1시간 동안 지지합니다. 응고 후, 삽입물로 플레이트를 70 % 에탄올 욕조에 30 분에서 1 시간 동안 담가 멸균한다.
다음으로, 피펫팅으로 알코올을 버리고, 플레이트를 세포 배양 후드에서 밤새 건조시킨다. 외근초와 인간 진피 미세혈관 내피 세포의 각질세포를 배양하기 위해 플라스크에서 배지를 버리고 5밀리리터의 트립신을 첨가하여 세포를 분리합니다. 5% 이산화탄소로 섭씨 37도에서 외근초의 각질형성세포가 들어있는 플라스크를 5분 동안 놓고 인간 진피 미세혈관 내피세포가 들어 있는 플라스크를 실온에서 5분 동안 배양한다.
15밀리리터의 멸균 원추형 튜브에 외근초의 각질형성세포가 포함된 트립신 용액을 5%FBS 및 성장인자로 보충된 중간엽 줄기세포 배지 5밀리리터와 혼합하고, 인간 진피 미세혈관 내피세포에 5%FBS 및 성장인자를 보충한 내피세포 배지 5밀리리터를 혼합합니다. 바깥쪽 뿌리초의 각질세포와 인간 진피 미세혈관 내피 세포 현탁액을 200 G에서 실온에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 버린 후, 세포를 각각의 배지 2 밀리리터에 재현 탁시킨다.
10 마이크로리터의 세포 현탁액을 10 마이크로리터의 트리판 블루 염료와 혼합하고, 혼합물의 10 마이크로리터를 카운팅 슬라이드의 챔버에 첨가한다. 계수 슬라이드를 세포 계수 시스템에 삽입하고 세포 번호와 생존력을 감지합니다. 각 배지에서 밀리리터 당 50, 000 세포의 농도로 세포 현탁액을 제조 한 후, 800 마이크로 리터 내지 1 밀리리터의 세포 현탁액을 개별 대형 구획에 분배하고, 100 내지 150 마이크로 리터를 피펫으로 개별 소형 구획에 분배한다.
5% FBS와 성장 인자를 보충한 중간엽 줄기 세포 배지의 각질세포와 내피 세포 배지의 인간 진피 미세혈관 내피 세포, 5% FBS와 작은 구획과 기타 큰 구획의 성장 인자를 참조하십시오. 세포 배양 접시를 5% 이산화탄소가 있는 섭씨 37도에 놓거나 일반적인 조건에서 세포 부착 및/또는 성숙을 허용합니다. 피펫을 사용하여 삽입물의 다른 구획의 배양 배지를 비웁니다.
그런 다음 큰 구획에서 섭씨 37도의 따뜻한 PBS 1밀리리터, 작은 구획에서 200마이크로리터로 세포를 헹굽니다. 모든 세포 유형에 대해 호환되도록 선택된 공통 배지 3밀리리터를 추가합니다. 공배양물이 들어 있는 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 24 내지 48시간 동안 놓는다.
세포 현탁액 계수를 위해 트립신을 이용하여 세포를 분리하고, 트립판 블루 염색법을 이용하여 생존율을 확인하였다. 형태를 관찰한 후, 배양 24 내지 48시간 후에 광학 현미경 하에서 실험 동안 상이한 구획의 세포 수를 계수한다. 먼저, 실험이 끝날 때 6웰 플레이트에서 인서트를 살짝 비틀어 제거한 다음, 인서트를 당겨 인서트에서 실리콘을 제거합니다.
기존의 세포 배양 세제와 세척 물질로 삽입물을 세척하십시오. 그런 다음 오토클레이브에서 나중에 사용할 수 있도록 삽입물을 멸균하거나 70% 에탄올 욕조에 1시간 동안 담그십시오. 표현형과 세포 생존율을 비교했는데, 여기서 90%의 생존율은 6개의 웰 플레이트의 웰에서 관찰되었고, 91%는 외부 치근초의 각질세포에 대한 3D 프린팅 삽입물에서 관찰되었습니다.
인간 진피 미세혈관 내피 세포의 생존율은 6웰 플레이트의 웰에서 85%인 반면, 3D 프린팅 삽입물에서는 86%였습니다. 3D 프린팅 삽입물에서 각질 세포와 내피 세포 사이의 간접 세포 통신은 삽입물에 각질 세포가 존재할 때 인간 진피 미세혈관 내피 세포의 증식이 대조군에 비해 24시간 후 1.5배, 48시간 후 3.1배 크게 증가했음을 입증했습니다. 그러나, 외근초 조건 배지의 각질형성세포는 24시간 후 1.5배, 48시간 후 2.1배 증가하여 인간 진피 미세혈관 내피세포 증식을 유의하게 증가시키는 것으로 나타났다.
3D 프린팅된 인서트 공동 배양 모델을 테스트하여 각질세포가 인간 진피 미세혈관 내피 세포 이동에 미치는 영향을 확인했습니다. 대조군 조건에서 내피 세포는 이동하여 24시간 후 상처 부위의 약 44%를 덮었습니다. 각질 세포의 존재 하에서, 인간 피부 미세 혈관 내피 세포 이동의 현저한 증가가 관찰되었으며, 이는 상처 부위의 43 % 67 %와 99 %가 각각 3 시간, 12 시간 및 24 시간 후에 덮여있는 것을 보여준다.
유사하게, HDMEC의 이동은 외부 치근초 상태 배지의 각질세포의 존재 하에서 증가합니다. 한 구획에서 다른 구획으로 세포 매체가 누출되는 것을 방지하기 위해 플레이트에 인서트를 밀봉하는 것이 중요합니다. 증식, 이동, 진정 형성 분석 DNA, RNA, 단백질 및 기타 분석과 같은 여러 응용 분야가 이루어질 수 있습니다.
