Dieses Protokoll kann zur Untersuchung zahlreicher Kulturstudien verwendet werden und bietet ein neues Werkzeug zur Untersuchung der direkten Zellkommunikation. Dieses neue Gerät spart viel Zeit bei der Erstellung eines Kulturmodells und ist auf verschiedene Zelltypen anwendbar, die eine bestimmte Beschichtung benötigen oder nicht. Die vier Kompartimente der 3D-gedruckten Einsätze ermöglichen es nämlich, verschiedene Zelltypen in Monolayern oder in 3D auf die gleiche Weise mit verschiedenen Kombinationen zu kultivieren.
Die 3D-gedruckten Einsätze sind langlebiger, flexibler, skalierbarer und können zur Entwicklung von experimentellen Modellen für die Untersuchung von Physiopathologien wie Immunologie oder Androgenese verwendet werden. Mischen Sie zunächst die beiden im Kit enthaltenen Komponenten, Lebensmittelsilizium und Katalysator, in einem Verhältnis von 10:1 mit einem sterilisierten Spatel mit 70 % Ethanol gemäß den Anweisungen des Herstellers. Tragen Sie die Einsätze mit einer Pinzette auf die Silikonmischung auf, so dass sich die Mischung homogen am unteren Rand des Einsatzes verteilt.
Setzen Sie die Einsätze in die Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte ein und üben Sie sanften Druck aus, um sicherzustellen, dass die Einsätze in engem Kontakt mit der Platte stehen, um ein Auslaufen des Zellkulturmediums zu vermeiden. Stellen Sie die Platte auf 37 Grad Celsius, um den Erstarrungsprozess des Siliziums eine Stunde lang zu unterstützen. Nach dem Erstarren sterilisieren Sie die Platten mit den Einsätzen, indem Sie sie 30 Minuten bis zu einer Stunde lang in ein 70%iges Ethanolbad tauchen.
Als nächstes entsorgen Sie den Alkohol durch Pipettieren und lassen die Platte über Nacht in einer Zellkulturhaube trocknen. Um die Keratinozyten der äußeren Wurzelscheide und der menschlichen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen zu kultivieren, entsorgen Sie das Medium aus den Kolben und fügen Sie fünf Milliliter Trypsin hinzu, um die Zellen abzulösen. Den Kolben mit den Keratinozyten der äußeren Wurzelscheide fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid erhitzen und den Kolben mit den menschlichen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.
Mischen Sie in einem sterilen konischen 15-Milliliter-Röhrchen die Trypsinlösung, die die Keratinozyten der äußeren Wurzelscheide enthält, mit fünf Millilitern mesenchymalem Stammzellmedium, das mit 5 % FBS und Wachstumsfaktoren ergänzt ist, und die menschlichen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen mit fünf Millilitern Endothelzellmedium, ergänzt mit 5 % FBS und Wachstumsfaktoren. Die Keratinozyten der äußeren Wurzelscheide und humane dermale mikrovaskuläre Endothelzellsuspensionen werden bei 200 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie die Zellen in zwei Millilitern ihres jeweiligen Mediums.
Mischen Sie 10 Mikroliter der Zellsuspension mit 10 Mikrolitern Trypanblaufarbstoff und geben Sie 10 Mikroliter der Mischung in die Kammer des Zählobjektträgers. Setzen Sie den Zählschieber in das Zellzählsystem ein und ermitteln Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit. Nach der Herstellung der Zellsuspension bei einer Konzentration von 50.000 Zellen pro Milliliter im jeweiligen Medium verteilen Sie 800 Mikroliter bis einen Milliliter der Zellsuspension in die einzelnen großen Kompartimente und 100 bis 150 Mikroliter in die einzelnen kleinen Kompartimente mit einer Pipette.
Sehen Sie sich die Keratinozyten in mesenchymalem Stammzellmedium an, die mit 5 % FBS und Wachstumsfaktoren ergänzt werden, und die humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen in Endothelzellmedium, ergänzt mit 5 % FBS und Wachstumsfaktoren in den kleinen und anderen großen Kompartimenten. Platzieren Sie die Zellkulturplatte bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid oder unter den üblichen Bedingungen, um die Zelladhäsion und/oder -reifung zu ermöglichen. Entleeren Sie das Nährmedium mit einer Pipette aus den verschiedenen Fächern der Einsätze.
Dann spülen Sie die Zellen mit einem Milliliter 37 Grad Celsius warmem PBS in den großen Fächern und 200 Mikrolitern in den kleinen Fächern. Fügen Sie drei Milliliter eines gängigen Mediums hinzu, das so ausgewählt wurde, dass es für alle Zelltypen kompatibel ist. Stellen Sie die Platte mit den Co-Kulturen 24 bis 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid auf.
Trennen Sie die Zellen mit Trypsin für die Zellsuspensionszählung ab und überprüfen Sie die Lebensfähigkeit mit Trypanblau-Färbung. Nach der Beobachtung der Morphologie wird die Zellzahl der verschiedenen Kompartimente während des Experiments unter einem Lichtmikroskop nach 24 bis 48 Stunden Inkubation gezählt. Entfernen Sie zunächst die Einsätze am Ende des Experiments durch eine leichte Drehung von der Sechs-Well-Platte und entfernen Sie dann das Silikon von den Einsätzen, indem Sie es abziehen.
Waschen Sie die Einsätze mit herkömmlichen Zellkulturreinigern und Reinigungsmitteln. Sterilisieren Sie dann die Einsätze für die zukünftige Verwendung in einem Autoklaven oder tauchen Sie sie eine Stunde lang in ein 70%iges Ethanolbad. Der Phänotyp und die Zellviabilität wurden verglichen, wobei eine Lebensfähigkeit von 90 % in den Wells der sechs Well-Platten und 91 % in den 3D-gedruckten Inserts für Keratinozyten der äußeren Wurzelscheide beobachtet wurde.
Die Lebensfähigkeit menschlicher dermaler mikrovaskulärer Endothelzellen betrug 85 % in den Vertiefungen der Sechs-Well-Platte, während 86 % in den 3D-gedruckten Einsätzen lagen. Die indirekte Zellkommunikation zwischen Keratinozyten und Endothelzellen in den 3D-gedruckten Inserts zeigte, dass in Gegenwart von Keratinozyten in den Inserts die Proliferation der humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen nach 24 Stunden signifikant um das 1,5-fache und nach 48 Stunden um das 3,1-fache im Vergleich zur Kontrolle zunahm. Es wurde jedoch gezeigt, dass der Keratinozyt des äußeren Wurzelscheidenbedingungsmediums die Proliferation menschlicher dermaler mikrovaskulärer Endothelzellen nach 24 Stunden um das 1,5-fache und nach 48 Stunden um das 2,1-fache erhöht.
Das 3D-gedruckte Insert-Co-Kulturmodell wurde getestet, um die Wirkung von Keratinozyten auf die Migration menschlicher dermaler mikrovaskulärer Endothelzellen zu bestimmen. In der Kontrollbedingung wanderten die Endothelzellen und bedeckten nach 24 Stunden etwa 44 % der Wundfläche. In Gegenwart von Keratinozyten wurde ein signifikanter Anstieg der Migration menschlicher dermaler mikrovaskulärer Endothelzellen beobachtet, was zeigt, dass 43 %, 67 % und 99 % der Wundfläche nach drei, 12 bzw. 24 Stunden bedeckt waren.
In ähnlicher Weise nimmt die Migration von HDMECs in Gegenwart von Keratinozyten des äußeren Wurzelscheidenbedingungsmediums zu. Es ist von entscheidender Bedeutung, die Abdichtung des Einsatzes an der Platte sicherzustellen, um das Austreten des Zellmediums von einem Kompartiment in ein anderes zu verhindern. Es könnten verschiedene Anwendungen durchgeführt werden, wie z. B. Proliferations-, Migrations-, Sedativbildungsassays für DNA-, RNA-, Protein- und andere Analysen.
