Dieses Protokoll ermöglicht die Expansion und genetische Manipulation von funktionellen hämatopoetischen Stammzellen der Maus und ermöglicht so ein tieferes Verständnis der Biologie und Hämatopoese hämatopoetischer Stammzellen. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie hämatopoetische Stammzellen in einer langfristigen ex vivo Kultur unterstützen kann und eine genetische Manipulation ermöglicht, um die Genetik der Hämatopoese zu hinterfragen. Dieses Kultursystem bietet eine Plattformtechnologie für verschiedene Studien zur hämatopoetischen Stammzellbiologie und Hämatopoese, einschließlich genetischer, molekularer und biochemischer Studien.
In der Tabelle zur Fehlerbehebung sind die Ursachen und Lösungen für die häufigsten Probleme aufgeführt, die bei dieser Technik auftreten. Es ist viel einfacher und effektiver zu zeigen, wie man Knochenmarkzellen richtig extrahiert und komplette Medienwechsel durchführt, als darüber zu lesen. Um mit der Extraktion hämatopoetischer Stammzellen (HSC) zu beginnen, verwenden Sie fusselfreie, empfindliche Tücher, um die Knochen zu reinigen, die frisch von ordnungsgemäß eingeschläferten Mäusen isoliert wurden.
Entfernen Sie Muskeln und Rückenmark von den Knochen, bevor Sie sie in einen Mörser geben, der etwa drei Milliliter PBS enthält. Zerdrücken Sie die Knochen mit einem Stößel, ohne sie zu zerkleinern, um die Scherkräfte zu minimieren. Brechen Sie dann mit einer 19-Gauge-Nadel, die an einer 5-Milliliter-Spritze befestigt ist, die großen Knochenmarkfragmente auf, die in das PBS freigesetzt werden, und übertragen Sie die Suspension durch einen 70-Mikron-Filter in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.
Sobald die Suspension übertragen wurde, wiederholen Sie den Vorgang mit frischem PBS, bis die Knochen gebleicht sind. Streben Sie ein Endvolumen von etwa 30 Millilitern pro Maus und 50 Milliliter für zwei Mäuse an, um die Knochen zu bleichen, bis kein Knochenmark mehr sichtbar ist. Bereiten Sie sich auf die Säulenanreicherung vor, indem Sie eine magnetische Filtrationssäule in den Magneten eines Magnetsäulenseparators mit einem 50-Mikron-Filter oben und einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen unten einsetzen.
Nachdem Sie die Zellen mit Allophycocyanin-Anti-c-Kit-Antikörpern und magnetischen Allophycocyanin-Mikrokügelchen behandelt haben, lassen Sie als Nächstes drei Milliliter steriles PBS durch den 50-Mikron-Filter und die Filtrationssäule laufen. Sobald das PBS durchlaufen ist, führen Sie die Zellsuspension durch die Säule, gefolgt von drei Waschgängen mit jeweils drei Millilitern kaltem PBS. Warten Sie nach jedem Waschgang, bis die Säule aufgehört hat zu tropfen, bevor Sie PBS für den nächsten Waschgang hinzufügen.
Entfernen Sie als Nächstes die Säule vom Magneten und legen Sie sie auf ein frisches 15-Milliliter-Röhrchen und geben Sie fünf Milliliter kaltes PBS in die Säule, bevor Sie den Säulenkolben darauf montieren und die Zellen durch Drücken des Kolbens eluieren. Befolgen Sie das im Text beschriebene Protokoll, um genügend HSC-Medium für die gewünschte Anzahl von Zellen oder Vertiefungen vorzubereiten, um 0,5 bis 1 Million Zellen pro Milliliter zu besiedeln. Anschließend werden die c-Kit-angereicherten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) heruntergedreht und das Pellet im frisch präparierten HSC-Medium mit der gewünschten Zelldichte resuspendiert.
Übertragen Sie die Zellen unter Beibehaltung des entsprechenden Volumens auf Fibronektin-beschichtete oder negativ oberflächengeladene Platten. Legen Sie die Zellen in einen Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Nachdem Sie die Platte vorsichtig aus dem Gewebekultur-Inkubator entfernt haben, ohne die Zellkulturen zu stören, verwenden Sie eine Pipette oder Vakuumpumpe, um langsam etwa 90 bis 95 % des Mediums aus dem flüssigen Meniskus jeder Vertiefung anzusaugen.
Vermeiden Sie es, Medium vom Boden der Vertiefung aufzuziehen. Dann einen Milliliter frisches, auf 37 Grad Celsius vorgewärmtes Medium in die Mulde geben. Legen Sie die Platte wieder in den Inkubator für Gewebekulturen zurück und wechseln Sie das Medium alle zwei bis drei Tage, bis das Experiment dies erfordert.
Nachdem Sie die Zellen in Nukleofektionspuffer resuspendiert haben, übertragen Sie die Zellsuspension sofort in das PCR-Röhrchen, das das komplexierte Ribonukleoprotein enthält, und mischen Sie sie vorsichtig durch langsames Auf- und Abpipettieren. Übertragen Sie nun das Gemisch sehr langsam in eine Elektroporationsküvette mit entsprechendem Volumen und halten Sie eine kontinuierliche Flüssigkeitsbewegung aufrecht, um die Bildung von Luftblasen in der Küvette zu vermeiden. Wählen Sie dann auf dem Elektroporator die Position der zu elektroporierenden Wells aus.
Wählen Sie über den Touchscreen das Zelltypprogramm als CD34-positiver Mensch aus oder geben Sie den Impulscode EO100 ein und drücken Sie dann die OK-Taste. Übertragen Sie die Küvette in den Elektroporator und drücken Sie die Starttaste auf dem Touchscreen, um die Elektroporation zu starten. Unmittelbar nach der Elektroporation wird das fünffache Reaktionsvolumen des Nährmediums in die Küvette gegeben.
Übertragen Sie nun die Zellen vorsichtig auf die vorbereitete Platte und legen Sie die Platte wieder in den Gewebekultur-Inkubator. Nachdem Sie einen Mediumwechsel durchgeführt haben, wie zuvor gezeigt, sammeln Sie 10 Mikroliter der Zellen und zählen Sie sie mit Turk-Lösung in einer Verdünnung von 1:2 mit einem Hämozytometer. Die erforderliche Dosis der Zellen wird für die Transduktion in mit Fibronektin beschichteten Platten neu plattiert und die nicht transduzierten Negativkontrollzellen separat plattiert.
Fügen Sie dann den lentiviralen Vektor zu jeder Vertiefung hinzu, die Zellen enthält, wobei eine Dosis von 20 Transduktionseinheiten pro Zelle beibehalten wird, um eine Transduktionseffizienz von etwa 30 % zu erreichen. Die lentivirale Vektordosis ist jedoch empirisch in Abhängigkeit von den experimentellen Anforderungen zu bestimmen. Zum Schluss werden die Zellen für sechs Stunden in den Gewebekultur-Inkubator zurückgeführt.
Führen Sie einen Medienwechsel wie zuvor beschrieben durch. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung der c-Kit-angereicherten HSCs ergab etwa 0,2% der Zellen, die CD150-positiv, CD34-negativ, c-Kit-positiv, Sca1-positiv und liniennegativ waren. Nach vierwöchiger HSPC-Kultur betrug die CD201-positive, CD150-positive, c-Kit-positive, Sca1-positive und lineage-negative Fraktion etwa 10 %Nach der Transduktion mit einem GFP-exprimierenden lentiviralen Vektor betrugen die GFP-positiven Zellen etwa 30 %Bei der Konfluation betrug die erwartete Dichte der Kulturen etwa 2 Millionen Zellen pro Milliliter.
Innerhalb der ersten 24 bis 48 Stunden vor dem ersten Mediumwechsel wurde ein Zelltod von etwa 50 % beobachtet. Nach einer Woche kehrte die Zellzahl jedoch auf 80 bis 100 % der ausgesäten Zellzahl zurück. Genaue Medienwechsel mit frischen und vorgewärmten Medien sind entscheidend für die Langzeitstabilität dieser HSC-Kulturmethode.
Seit der Veröffentlichung der ursprünglichen Methode im Jahr 2019 hat das Fachgebiet begonnen, sie auf unterschiedliche Weise zur Untersuchung der HSZ-Biologie einzusetzen.
