Este protocolo permite a expansão e manipulação genética de células-tronco hematopoéticas funcionais de camundongos, permitindo um entendimento mais aprofundado da biologia das células-tronco hematopoéticas e da hematopoese. A vantagem desta técnica é que ela pode apoiar células-tronco hematopoéticas em cultura ex vivo de longo prazo e permitir a manipulação genética para interrogar a genética da hematopoiese. Este sistema de cultura fornece uma tecnologia de plataforma para vários estudos em biologia de células-tronco hematopoéticas e hematopoiese, incluindo estudos genéticos, moleculares e bioquímicos.
A tabela de solução de problemas lista as causas e soluções para as dificuldades comuns encontradas com essa técnica. É muito mais fácil e eficaz mostrar como extrair corretamente as células da medula óssea e realizar mudanças completas na mídia em vez de ler sobre isso. Para iniciar a extração de células-tronco hematopoéticas, ou HSC, use lenços de tarefa delicados sem fiapos para limpar os ossos recém-isolados de camundongos devidamente eutanasiados.
Remova os músculos e a medula espinhal dos ossos antes de adicioná-los a uma argamassa contendo aproximadamente três mililitros de PBS. Usando um pilão, esmague os ossos sem triturá-los para minimizar as forças de cisalhamento. Em seguida, usando uma agulha de calibre 19 acoplada a uma seringa de 5 mililitros, quebre os grandes fragmentos de medula óssea liberados no PBS e transfira a suspensão através de um filtro de 70 mícrons para um tubo cônico de 50 mililitros.
Uma vez transferida a suspensão, repita o processo com PBS fresco até que os ossos estejam clareados. Procure um volume final de aproximadamente 30 mililitros por camundongo e 50 mililitros para dois camundongos para branquear os ossos até que nenhuma medula seja mais visível. Prepare-se para o enriquecimento da coluna colocando uma coluna de filtração magnética no ímã de um separador de coluna magnética com um filtro de 50 mícrons na parte superior e um tubo cônico de 15 mililitros abaixo.
Em seguida, depois de tratar as células com o anticorpo anti-c-Kit aloficocianina e microesferas magnéticas de aloficocianina, passe três mililitros de PBS estéril através do filtro de 50 mícrons e da coluna de filtração. Uma vez que o PBS tenha passado, passe a suspensão da célula através da coluna, seguido por três lavagens de três mililitros de PBS frio de cada vez. Após cada lavagem, espere que a coluna pare de pingar antes de adicionar PBS para a próxima lavagem.
Em seguida, remova a coluna do ímã e coloque-a em cima de um tubo fresco de 15 mililitros e adicione cinco mililitros de PBS frio na coluna antes de encaixar o êmbolo da coluna nela e eluir as células empurrando o êmbolo. Siga o protocolo descrito no texto para preparar meio HSC suficiente para o número desejado de células ou poços para semear de 0,5 a 1 milhão de células por mililitro. Em seguida, gire as células-tronco hematopoéticas e progenitoras enriquecidas com c-Kit, ou HSPCs, e ressuspenda o pellet no meio HSC recém-preparado na densidade celular desejada.
Transferir as células para placas revestidas com fibronectina ou com carga superficial negativa, mantendo o volume adequado. Coloque as células em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Depois de remover suavemente a placa da incubadora de cultura de tecidos sem perturbar as culturas celulares, use uma pipeta ou bomba de vácuo para aspirar lentamente cerca de 90 a 95% do meio do menisco líquido de cada poço.
Evite tirar o meio da base do poço. Em seguida, adicione um mililitro de meio fresco pré-aquecido a 37 graus Celsius no poço. Retorne a placa à incubadora de cultura de tecidos e troque o meio a cada dois ou três dias até que o experimento necessite.
Depois de ressuspender as células em tampão de nucleofeção, transfira imediatamente a suspensão celular para o tubo de PCR contendo a ribonucleoproteína complexada e misture suavemente pipetando para cima e para baixo lentamente. Agora transfira a mistura para uma cubeta de eletroporação de volume adequado muito lentamente, mantendo um movimento contínuo de fluido para evitar a formação de bolhas de ar dentro da cubeta. Em seguida, no eletroporador, selecione a posição dos poços que estão sendo eletroporados.
Usando a tela sensível ao toque, selecione o programa de tipo de célula como CD34-positivo humano ou digite o código de pulso EO100 e, em seguida, pressione o botão OK. Transfira a cubeta para o eletroporator e pressione o botão Iniciar na tela sensível ao toque para iniciar a eletroporação. Imediatamente após a eletroporação, adicionar cinco vezes o volume de reação do meio de cultura à cubeta.
Agora, transfira suavemente as células para a placa preparada e coloque a placa de volta na incubadora de cultura de tecidos. Depois de realizar uma troca de meio como demonstrado anteriormente, coletar 10 microlitros das células e contá-las usando solução de Turk em uma diluição de 1:2 com um hemocitômetro. Replaquear a dose necessária de células em placas revestidas com fibronectina para transdução e, separadamente, plaquear as células de controle negativo não transduzidas.
Em seguida, adicione o vetor lentiviral a cada poço contendo células, mantendo uma dose de 20 unidades de transdução por célula para atingir cerca de 30% de eficiência de transdução. No entanto, determinar a dose do vetor lentiviral empiricamente dependendo das exigências experimentais. Finalmente, retornar as células à incubadora de cultura de tecidos por seis horas.
Execute uma alteração de meio conforme descrito anteriormente. A classificação celular ativada por fluorescência das HSCs enriquecidas com c-Kit produziu aproximadamente 0,2% das células CD150-positivas, CD34-negativas, c-Kit-positivas, Sca1-positivas e linhagens-negativas. Após quatro semanas de cultura de HSPC, as frações CD201-positivas, CD150-positivas, c-Kit-positivas, Sca1-positivas e linhagens-negativas foram encontradas para ser cerca de 10% Após a transdução com um vetor lentiviral que expressa GFP, as células positivas para GFP foram aproximadamente 30%Quando confluentes, a densidade esperada das culturas era de cerca de 2 milhões de células por mililitro.
Aproximadamente 50% de morte celular foi observada nas primeiras 24 a 48 horas antes da primeira troca de meio. Após uma semana, no entanto, o número de células retornou a 80 a 100% do número de células semeadas. Mudanças precisas de mídia usando meios frescos e pré-aquecidos são críticas para a estabilidade a longo prazo deste método de cultura HSC.
Desde que o método original foi publicado em 2019, a área começou a usá-lo de diferentes maneiras para estudar a biologia do HSC.
