פרוטוקול זה מאפשר הרחבה ומניפולציה גנטית של תאי גזע המטופויטיים פונקציונליים של עכברים, ומאפשר הבנה עמוקה יותר של ביולוגיה של תאי גזע המטופויטיים והמטופויזיס. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לתמוך בתאי גזע המטופויטיים בתרבית אקס ויו ארוכת טווח ולאפשר מניפולציה גנטית כדי לחקור את הגנטיקה של המטופויזה. מערכת תרבית זו מספקת טכנולוגיית פלטפורמה למחקרים שונים בביולוגיה של תאי גזע המטופויטיים והמטופויזיס, כולל מחקרים גנטיים, מולקולריים וביוכימיים.
טבלת פתרון הבעיות מפרטת את הסיבות והפתרונות למאבקים הנפוצים שבהם נתקלת טכניקה זו. הרבה יותר קל ויעיל להראות איך לחלץ נכון תאי מח עצם ולבצע שינויי מדיה מלאים במקום לקרוא על זה. כדי להתחיל במיצוי תאי גזע המטופויטיים, או HSC, השתמשו במגבוני משימה עדינים ללא סיבים כדי לנקות את העצמות שבודדו זה עתה מעכברים שעברו המתת חסד נכונה.
הסר את השרירים ואת חוט השדרה מהעצמות לפני הוספתם למכתש המכיל כשלושה מיליליטר PBS. באמצעות מזיק, למחוץ את העצמות מבלי לטחון אותם כדי למזער את כוחות הגזירה. לאחר מכן, באמצעות מחט 19 מד המחוברת למזרק 5 מיליליטר, לפרק את שברי מח העצם הגדולים ששוחררו לתוך PBS ולהעביר את המתלה דרך מסנן 70 מיקרון לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר.
לאחר העברת המתלים, חזור על התהליך עם PBS טרי עד שהעצמות מולבנים. יש לשאוף לנפח סופי של כ-30 מיליליטר לעכבר ו-50 מיליליטר לשני עכברים שילבינו את העצמות עד שלא ייראה מח מוח נוסף. התכוננו להעשרת עמודים על ידי הצבת עמוד סינון מגנטי לתוך מגנט של מפריד עמודים מגנטי עם מסנן 50 מיקרון למעלה וצינור חרוטי 15 מיליליטר מתחת.
לאחר מכן, לאחר טיפול בתאים עם נוגדן אנטי-c-Kit אלופיקוציאנין ומיקרו-חרוזים מגנטיים אלופיקוציאנין, הפעל שלושה מיליליטר של PBS סטרילי דרך מסנן 50 מיקרון ועמודת הסינון. לאחר שה-PBS עבר, העבירו את תרחיף התא דרך העמודה, ואחריו שלוש שטיפות של שלושה מיליליטר של PBS קר בכל פעם. לאחר כל כביסה, המתינו עד שהעמוד יפסיק לטפטף לפני הוספת PBS לשטיפה הבאה.
לאחר מכן, הסר את העמוד מהמגנט והנח אותו על גבי צינור טרי של 15 מיליליטר והוסף חמישה מיליליטר של PBS קר לתוך העמוד לפני התאמת בוכנה העמוד אליו ופליטת התאים על ידי דחיפת הבוכנה. עקוב אחר הפרוטוקול המתואר בטקסט כדי להכין מספיק מדיום HSC למספר הרצוי של תאים או בארות לזרוע 0.5 עד 1 מיליון תאים למיליליטר. לאחר מכן סובבו מטה את תאי הגזע ותאי האב ההמטופויטיים המועשרים ב-c-Kit, או HSPCs, והשהו מחדש את הגלולה בתווך HSC שזה עתה הוכן בצפיפות התא הרצויה.
העבר את התאים ללוחות מצופים פיברונקטין או טעוני משטח שליליים, תוך שמירה על נפח מתאים. מקמים את התאים באינקובטור תרבית רקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר הסרה עדינה של הצלחת מאינקובטור תרביות הרקמה מבלי להפריע לתרביות התא, השתמשו בפיפטה או במשאבת ואקום כדי לשאוף באיטיות כ-90% עד 95% מהתווך מהמניסקוס הנוזלי של כל באר.
הימנעו מציור מדיום מבסיס הבאר. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של מדיום טרי שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס לתוך הבאר. מחזירים את הצלחת לאינקובטור תרביות הרקמה, ומחליפים מדיה כל יומיים-שלושה עד שהניסוי דורש.
לאחר השעיה מחדש של התאים במאגר נוקלאופקציה, העבירו מיד את תרחיף התא לצינור ה-PCR המכיל את הריבונוקלאו פרוטאין המורכב, וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג מעלה ומטה באיטיות. כעת מעבירים את התערובת לקובט אלקטרופורציה בנפח מתאים לאט מאוד, תוך שמירה על תנועת נוזל רציפה כדי למנוע היווצרות בועות אוויר בתוך הקובט. לאחר מכן, על electroporator, לבחור את המיקום של הבארות להיות electroporated.
באמצעות מסך המגע, בחר את תוכנית סוג התא כאדם חיובי CD34 או הקלד את קוד הדופק EO100 ולאחר מכן לחץ על הלחצן אישור. העבר את הקובט לאלקטרופורטור ולחץ על לחצן התחל במסך המגע כדי להתחיל אלקטרופורציה. מיד לאחר ההתחשמלות, מוסיפים לקובט פי חמישה מנפח התגובה של מדיום התרבית.
כעת מעבירים בעדינות את התאים לצלחת המוכנה, ומחזירים את הצלחת לאינקובטור תרבית הרקמות. לאחר ביצוע שינוי בינוני כפי שהודגם קודם לכן, לאסוף 10 מיקרוליטר של התאים ולספור אותם באמצעות הפתרון של טורק בדילול של 1: 2 עם המוציטומטר. להחזיר את המינון הנדרש של תאים בלוחות מצופים פיברונקטין להתמרה, ובנפרד, צלחת את תאי הבקרה השליליים untransduced.
לאחר מכן הוסף את הווקטור הלנטיויראלי לכל באר המכילה תאים, תוך שמירה על מינון של 20 יחידות התמרה לכל תא כדי להשיג יעילות התמרה של כ -30%. עם זאת, לקבוע את מינון וקטור lentiviral באופן אמפירי בהתאם לדרישות הניסוי. לבסוף, להחזיר את התאים לאינקובטור תרבית הרקמה למשך שש שעות.
בצע שינוי בינוני כפי שתואר קודם לכן. מיון התאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות של HSCs מועשרים ב-c-Kit הניב כ-0.2% מהתאים שהיו חיוביים ל-CD150, CD34-שליליים, c-Kit-חיוביים, Sca1-חיוביים ושושלת שלילית. לאחר ארבעה שבועות של תרבית HSPC, נמצא כי השברים החיוביים ל-CD201, CD150-חיוביים, c-Kit-חיוביים, Sca1-חיוביים ושושלות שליליים הם כ-10%לאחר התמרה עם וקטור לנטי-ויראלי המבטא GFP, התאים החיוביים ל-GFP היו כ-30% כאשר הם נפגשים, הצפיפות הצפויה של התרביות הייתה סביב 2 מיליון תאים למיליליטר.
כ-50% מוות תאי נצפה במהלך 24 עד 48 השעות הראשונות לפני ביצוע השינוי הבינוני הראשון. עם זאת, לאחר שבוע, מספרי התאים חזרו ל-80% עד 100% ממספר התאים שנזרעו. שינויי מדיה מדויקים באמצעות מדיה רעננה ומחוממת מראש הם קריטיים ליציבות ארוכת הטווח של שיטת תרבות HSC זו.
מאז פורסמה השיטה המקורית בשנת 2019, החל התחום להשתמש בה בדרכים שונות לחקר ביולוגיה של HSC.
