Bu protokol, fonksiyonel fare hematopoetik kök hücrelerinin genişlemesine ve genetik manipülasyonuna izin vererek, hematopoetik kök hücre biyolojisi ve hematopoezin daha iyi anlaşılmasını sağlar. Bu tekniğin avantajı, uzun süreli ex vivo kültürde hematopoetik kök hücreleri destekleyebilmesi ve hematopoez genetiğini sorgulamak için genetik manipülasyona izin vermesidir. Bu kültür sistemi, genetik, moleküler ve biyokimyasal çalışmalar da dahil olmak üzere hematopoetik kök hücre biyolojisi ve hematopoez ile ilgili çeşitli çalışmalar için bir platform teknolojisi sağlar.
Sorun giderme tablosu, bu teknikle karşılaşılan yaygın mücadelelerin nedenlerini ve çözümlerini listeler. Kemik iliği hücrelerinin nasıl doğru bir şekilde çıkarılacağını ve okumak yerine tam medya değişikliklerinin nasıl yapılacağını göstermek çok daha kolay ve etkilidir. Hematopoetik kök hücre veya HSC, ekstraksiyona başlamak için, uygun şekilde ötenazi yapılmış farelerden taze izole edilmiş kemikleri temizlemek için tüy bırakmayan hassas görev mendilleri kullanın.
Kasları ve omuriliği, yaklaşık üç mililitre PBS içeren bir harç içine eklemeden önce kemiklerden çıkarın. Bir havane kullanarak, kesme kuvvetlerini en aza indirmek için kemikleri öğütmeden ezin. Daha sonra, 5 mililitrelik bir şırıngaya tutturulmuş 19 kalibrelik bir iğne kullanarak, PBS'ye salınan büyük kemik iliği parçalarını parçalayın ve süspansiyonu 70 mikronluk bir filtreden 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın.
Süspansiyon aktarıldıktan sonra, kemikler ağartılana kadar işlemi taze PBS ile tekrarlayın. Fare başına yaklaşık 30 mililitre ve iki fare için 50 mililitrelik bir uç hacmi hedefleyin, daha fazla ilik görünmeyene kadar kemikleri ağartın. Üstünde 50 mikron filtre ve altında 15 mililitrelik konik tüp bulunan manyetik kolon ayırıcının mıknatısına manyetik bir filtrasyon kolonu yerleştirerek kolon zenginleştirmeye hazırlanın.
Daha sonra, hücreleri allophycocyanin anti-c-Kit antikoru ve allophycocyanin manyetik mikroboncukları ile tedavi ettikten sonra, 50 mikron filtre ve filtrasyon sütunundan üç mililitre steril PBS çalıştırın. PBS geçtikten sonra, hücre süspansiyonunu sütundan geçirin, ardından her seferinde üç mililitre soğuk PBS'nin üç yıkamasını yapın. Her yıkamadan sonra, bir sonraki yıkama için PBS eklemeden önce sütunun damlamasının durmasını bekleyin.
Daha sonra, sütunu mıknatıstan çıkarın ve taze bir 15 mililitrelik tüpün üzerine yerleştirin ve kolon pistonunu üzerine takmadan ve pistonu iterek hücreleri sökmeden önce kolona beş mililitre soğuk PBS ekleyin. Mililitre başına 0,5 ila 1 milyon hücreyi tohumlamak için istenen sayıda hücre veya kuyucuk için yeterli HSC ortamı hazırlamak üzere metinde açıklanan protokolü izleyin. Daha sonra c-Kit ile zenginleştirilmiş hematopoetik kök ve progenitör hücreleri veya HSPC'leri döndürün ve peleti taze hazırlanmış HSC ortamında istenen hücre yoğunluğunda yeniden askıya alın.
Hücreleri fibronektin kaplı veya negatif yüzey yüklü plakalara aktararak uygun hacmi koruyun. Hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Hücre kültürlerini rahatsız etmeden plakayı doku kültürü inkübatöründen nazikçe çıkardıktan sonra, ortamın yaklaşık% 90 ila% 95'ini her bir kuyucuğun sıvı menisküsünden yavaşça aspire etmek için bir pipet veya vakum pompası kullanın.
Kuyunun tabanından ortam çekmekten kaçının. Ardından, kuyuya 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış bir mililitre taze ortam ekleyin. Plakayı doku kültürü inkübatörüne geri gönderin ve deney gerektirene kadar her iki ila üç günde bir ortamı değiştirin.
Hücreleri nükleofeksiyon tamponunda yeniden askıya aldıktan sonra, hücre süspansiyonunu derhal kompleks ribonükleoproteini içeren PCR tüpüne aktarın ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın. Şimdi karışımı uygun hacimde bir elektroporasyon küvetine çok yavaş bir şekilde aktarın ve küvetin içinde hava kabarcıkları oluşmasını önlemek için sürekli bir sıvı hareketini koruyun. Ardından, elektroporatörde, elektroporasyona tabi tutulan kuyucukların konumunu seçin.
Dokunmatik ekranı kullanarak, hücre tipi programını CD34-pozitif insan olarak seçin veya EO100 darbe kodunu yazın ve ardından OK düğmesine basın. Küveti elektroporatöre aktarın ve elektroporasyonu başlatmak için dokunmatik ekrandaki Başlat düğmesine basın. Elektroporasyondan hemen sonra, kültür ortamının reaksiyon hacminin beş katını küvete ekleyin.
Şimdi hücreleri yavaşça hazırlanan plakaya aktarın ve plakayı doku kültürü inkübatörüne geri yerleştirin. Daha önce gösterildiği gibi bir ortam değişikliği yaptıktan sonra, hücrelerin 10 mikrolitresini toplayın ve bir hemositometre ile 1: 2'lik bir seyreltmede Türk çözeltisini kullanarak sayın. Transdüksiyon için fibronektin kaplı plakalarda gerekli hücre dozunu yeniden plakalayın ve ayrı olarak, transdübe edilmemiş negatif kontrol hücrelerini plakalayın.
Daha sonra lentiviral vektörü her bir kuyucuk içeren hücreye ekleyin ve yaklaşık% 30 transdüksiyon verimliliği elde etmek için hücre başına 20 transdüksiyon birimi dozunu koruyun. Bununla birlikte, deneysel gereksinimlere bağlı olarak lentiviral vektör dozunu ampirik olarak belirleyin. Son olarak, hücreleri altı saat boyunca doku kültürü inkübatörüne geri gönderin.
Daha önce açıklandığı gibi bir orta değişiklik gerçekleştirin. C-Kit ile zenginleştirilmiş HSC'lerin floresan ile aktive edilmiş hücre sıralaması, CD150-pozitif, CD34-negatif, c-Kit-pozitif, Sca1-pozitif ve soy-negatif olan hücrelerin yaklaşık% 0.2'sini verdi. Dört haftalık HSPC kültüründen sonra, CD201-pozitif, CD150-pozitif, c-Kit-pozitif, Sca1-pozitif ve soy-negatif fraksiyonların yaklaşık% 10 olduğu bulunduGFP eksprese eden bir lentiviral vektör ile transdüksiyonu takiben, GFP-pozitif hücreler yaklaşık% 30 idi.
İlk ortam değişikliğinin yapılmasından önceki ilk 24 ila 48 saat içinde yaklaşık% 50 hücre ölümü gözlendi. Bununla birlikte, bir hafta sonra, hücre sayıları, tohumlanan hücre sayısının% 80 ila% 100'üne geri döndü. Taze ve önceden ısıtılmış ortamların kullanıldığı doğru ortam değişiklikleri, bu HSC kültür yönteminin uzun vadeli kararlılığı için kritik öneme sahiptir.
Orijinal yöntem 2019 yılında yayınlandığından beri, alan HSC biyolojisini incelemek için farklı şekillerde kullanmaya başlamıştır.
