Questo protocollo consente l'espansione e la manipolazione genetica delle cellule staminali ematopoietiche funzionali del topo, consentendo una comprensione più profonda della biologia delle cellule staminali ematopoietiche e dell'emopoiesi. Il vantaggio di questa tecnica è che può supportare le cellule staminali ematopoietiche in colture ex vivo a lungo termine e consentire la manipolazione genetica per interrogare la genetica dell'emopoiesi. Questo sistema di coltura fornisce una piattaforma tecnologica per vari studi sulla biologia delle cellule staminali ematopoietiche e sull'emopoiesi, compresi studi genetici, molecolari e biochimici.
Nella tabella di risoluzione dei problemi sono elencate le cause e le soluzioni per le difficoltà comuni incontrate con questa tecnica. È molto più facile ed efficace mostrare come estrarre correttamente le cellule del midollo osseo ed eseguire modifiche complete ai media piuttosto che leggerle. Per iniziare l'estrazione con cellule staminali ematopoietiche, o HSC, utilizzare salviette delicate prive di lanugine per pulire le ossa appena isolate dai topi correttamente eutanasiati.
Rimuovere i muscoli e il midollo spinale dalle ossa prima di aggiungerli a un mortaio contenente circa tre millilitri di PBS. Usando un pestello, schiacciare le ossa senza macinarle per ridurre al minimo le forze di taglio. Quindi, utilizzando un ago calibro 19 collegato a una siringa da 5 millilitri, rompere i grandi frammenti di midollo osseo rilasciati nel PBS e trasferire la sospensione attraverso un filtro da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri.
Una volta trasferita la sospensione, ripetere il processo con PBS fresco fino a quando le ossa sono sbiancate. Punta a un volume finale di circa 30 millilitri per topo e 50 millilitri per due topi per sbiancare le ossa fino a quando non è più visibile il midollo. Preparare l'arricchimento della colonna posizionando una colonna di filtrazione magnetica nel magnete di un separatore di colonne magnetiche con un filtro da 50 micron sulla parte superiore e un tubo conico da 15 millilitri sotto.
Successivamente, dopo aver trattato le cellule con l'anticorpo anti-c-Kit alloficocianina e le microsfere magnetiche alloficocianina, eseguire tre millilitri di PBS sterile attraverso il filtro da 50 micron e la colonna di filtrazione. Una volta che il PBS è passato, passare la sospensione cellulare attraverso la colonna, seguita da tre lavaggi di tre millilitri di PBS freddo ogni volta. Dopo ogni lavaggio, attendere che la colonna smetta di gocciolare prima di aggiungere PBS per il lavaggio successivo.
Quindi, rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla sopra un tubo fresco da 15 millilitri e aggiungere cinque millilitri di PBS freddo nella colonna prima di montare lo stantuffo della colonna su di esso e eluire le celle spingendo lo stantuffo. Seguire il protocollo descritto nel testo per preparare abbastanza terreno HSC per il numero desiderato di cellule o pozzetti per seminare da 0,5 a 1 milione di cellule per millilitro. Quindi ruotare verso il basso le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche arricchite con c-Kit, o HSPC, e risospendere il pellet nel mezzo HSC appena preparato alla densità cellulare desiderata.
Trasferire le cellule su piastre rivestite di fibronectina o caricate superficialmente negativa, mantenendo un volume appropriato. Posizionare le cellule in un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo aver rimosso delicatamente la piastra dall'incubatore di coltura tissutale senza disturbare le colture cellulari, utilizzare una pipetta o una pompa per vuoto per aspirare lentamente circa il 90-95% del mezzo dal menisco liquido di ciascun pozzetto.
Evitare di prelevare il mezzo dalla base del pozzo. Quindi aggiungere un millilitro di mezzo fresco preriscaldato a 37 gradi Celsius nel pozzo. Restituire la piastra all'incubatore di coltura tissutale e cambiare i terreni ogni due o tre giorni fino a quando l'esperimento non lo richiede.
Dopo aver risospeso le cellule nel tampone di nucleofezione, trasferire immediatamente la sospensione cellulare nel tubo PCR contenente la ribonucleoproteina complessata e mescolare delicatamente pipettando su e giù lentamente. Ora trasferite la miscela in una cuvetta elettroporazione di volume appropriato molto lentamente, mantenendo un movimento fluido continuo per evitare di formare bolle d'aria all'interno della cuvetta. Quindi, sull'elettroporatore, selezionare la posizione dei pozzetti da elettroporare.
Utilizzando il touchscreen, selezionare il tipo di cella programma come umano CD34-positivo o digitare il codice di impulso EO100, quindi premere il pulsante OK. Trasferire la cuvetta all'elettroporatore e premere il pulsante Start sul touchscreen per avviare l'elettroporazione. Immediatamente dopo l'elettroporazione, aggiungere cinque volte il volume di reazione del terreno di coltura alla cuvetta.
Ora trasferisci delicatamente le cellule sulla piastra preparata e rimetti la piastra nell'incubatore di coltura tissutale. Dopo aver eseguito un cambiamento medio come dimostrato in precedenza, raccogliere 10 microlitri di cellule e contarle usando la soluzione di Turk ad una diluizione di 1: 2 con un emocitometro. Riplaccare la dose richiesta di cellule in piastre rivestite di fibronectina per la trasduzione e, separatamente, placcare le cellule di controllo negative non trasdotte.
Quindi aggiungere il vettore lentivirale a ciascun pozzetto contenente cellule, mantenendo una dose di 20 unità di trasduzione per cellula per ottenere circa il 30% di efficienza di trasduzione. Tuttavia, determinare empiricamente la dose del vettore lentivirale a seconda dei requisiti sperimentali. Infine, riportare le cellule nell'incubatore di coltura tissutale per sei ore.
Eseguire una modifica media come descritto in precedenza. La selezione cellulare attivata dalla fluorescenza delle HSC arricchite con c-Kit ha prodotto circa lo 0,2% delle cellule CD150-positive, CD34-negative, c-Kit-positive, Sca1-positive e ligname-negative. Dopo quattro settimane di coltura HSPC, le frazioni CD201-positive, CD150-positive, c-Kit-positive, Sca1-positive e ligname-negative sono risultate essere circa il 10%Dopo la trasduzione con un vettore lentivirale che esprime GFP, le cellule GFP-positive erano circa il 30% Quando confluenti, la densità attesa delle colture era di circa 2 milioni di cellule per millilitro.
Circa il 50% della morte cellulare è stata osservata entro le prime 24-48 ore prima che fosse eseguito il primo cambiamento del mezzo. Dopo una settimana, tuttavia, il numero di cellule è tornato all'80-100% del numero di cellule seminate. Cambi accurati dei supporti utilizzando supporti freschi e preriscaldati sono fondamentali per la stabilità a lungo termine di questo metodo di coltura HSC.
Da quando il metodo originale è stato pubblicato nel 2019, il campo ha iniziato a usarlo in modi diversi per studiare la biologia HSC.
