Este protocolo permite la expansión y manipulación genética de células madre hematopoyéticas funcionales de ratón, lo que permite una comprensión más profunda de la biología de las células madre hematopoyéticas y la hematopoyesis. La ventaja de esta técnica es que puede soportar células madre hematopoyéticas en cultivo ex vivo a largo plazo y permitir la manipulación genética para interrogar la genética de la hematopoyesis. Este sistema de cultivo proporciona una tecnología de plataforma para diversos estudios sobre la biología de las células madre hematopoyéticas y la hematopoyesis, incluidos los estudios genéticos, moleculares y bioquímicos.
La tabla de solución de problemas enumera las causas y soluciones para las luchas comunes encontradas con esta técnica. Es mucho más fácil y más efectivo mostrar cómo extraer correctamente las células de la médula ósea y realizar cambios completos en los medios en lugar de leer sobre ello. Para comenzar la extracción de células madre hematopoyéticas, o HSC, use toallitas delicadas sin pelusa para limpiar los huesos recién aislados de ratones debidamente sacrificados.
Retire los músculos y la médula espinal de los huesos antes de agregarlos a un mortero que contenga aproximadamente tres mililitros de PBS. Usando un mortero, aplaste los huesos sin molerlos para minimizar las fuerzas de cizallamiento. Luego, usando una aguja de calibre 19 conectada a una jeringa de 5 mililitros, rompa los fragmentos grandes de médula ósea liberados en el PBS y transfiera la suspensión a través de un filtro de 70 micras a un tubo cónico de 50 mililitros.
Una vez que la suspensión haya sido transferida, repita el proceso con PBS fresco hasta que los huesos estén blanqueados. Apunte a un volumen final de aproximadamente 30 mililitros por ratón y 50 mililitros para que dos ratones blanqueen los huesos hasta que no se vea más médula. Prepárese para el enriquecimiento de la columna colocando una columna de filtración magnética en el imán de un separador de columna magnética con un filtro de 50 micras en la parte superior y un tubo cónico de 15 mililitros debajo.
Luego, después de tratar las células con anticuerpo anti-c-Kit de aloficocianina y microperlas magnéticas de aloficocianina, pase tres mililitros de PBS estéril a través del filtro de 50 micras y la columna de filtración. Una vez que el PBS haya pasado, pase la suspensión celular a través de la columna, seguido de tres lavados de tres mililitros de PBS frío cada vez. Después de cada lavado, espere a que la columna deje de gotear antes de agregar PBS para el siguiente lavado.
A continuación, retire la columna del imán y colóquela encima de un tubo fresco de 15 mililitros y agregue cinco mililitros de PBS frío en la columna antes de colocar el émbolo de la columna en él y eluyer las células empujando el émbolo. Siga el protocolo descrito en el texto para preparar suficiente medio HSC para el número deseado de células o pocillos para sembrar de 0,5 a 1 millón de células por mililitro. Luego gire las células madre y progenitoras hematopoyéticas enriquecidas con c-Kit, o HSPC, y vuelva a suspender el gránulo en el medio HSC recién preparado a la densidad celular deseada.
Transfiera las células a placas recubiertas de fibronectina o cargadas superficialmente negativas, manteniendo el volumen adecuado. Coloque las células en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de retirar suavemente la placa de la incubadora de cultivo de tejidos sin alterar los cultivos celulares, use una pipeta o una bomba de vacío para aspirar lentamente aproximadamente del 90 al 95% del medio del menisco líquido de cada pocillo.
Evite extraer el medio de la base del pozo. Luego agregue un mililitro de medio fresco precalentado a 37 grados centígrados en el pozo. Devuelva la placa a la incubadora de cultivo de tejidos y cambie los medios cada dos o tres días hasta que el experimento lo requiera.
Después de resuspender las células en tampón de nucleofección, transfiera inmediatamente la suspensión celular al tubo de PCR que contiene la ribonucleoproteína complejada y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo lentamente. Ahora transfiera la mezcla a una cubeta de electroporación de volumen apropiado muy lentamente, manteniendo un movimiento continuo del fluido para evitar la formación de burbujas de aire dentro de la cubeta. Luego, en el electroporador, seleccione la posición de los pocillos que se están electroporando.
Con la pantalla táctil, seleccione el programa de tipo de célula como humano CD34-positivo o escriba el código de pulso EO100 y, a continuación, pulse el botón OK. Transfiera la cubeta al electroporador y pulse el botón Inicio de la pantalla táctil para iniciar la electroporación. Inmediatamente después de la electroporación, agregue cinco veces el volumen de reacción del medio de cultivo a la cubeta.
Ahora transfiera suavemente las células a la placa preparada y vuelva a colocar la placa en la incubadora de cultivo de tejidos. Después de realizar un cambio medio como se demostró anteriormente, recolecte 10 microlitros de las células y cuéntelas usando la solución de Turk en una dilución de 1: 2 con un hemocitómetro. Replacar la dosis requerida de células en placas recubiertas de fibronectina para la transducción, y por separado, colocar en placa las células de control negativo no transducidas.
Luego agregue el vector lentiviral a cada célula que contiene pocillos, manteniendo una dosis de 20 unidades de transducción por célula para lograr una eficiencia de transducción de alrededor del 30%. Sin embargo, determinar la dosis del vector lentiviral empíricamente dependiendo de los requisitos experimentales. Finalmente, devuelva las células a la incubadora de cultivo de tejidos durante seis horas.
Realice un cambio medio como se describió anteriormente. La clasificación celular activada por fluorescencia de las HSC enriquecidas con c-Kit produjo aproximadamente el 0,2% de las células que eran CD150 positivas, CD34 negativas, c-Kit-positivas, Sca1 positivas y linaje negativo. Después de cuatro semanas de cultivo de HSPC, se encontró que las fracciones CD201-positivas, CD150-positivas, c-Kit-positivas, Sca1-positivas y linaje-negativas eran de alrededor del 10%Después de la transducción con un vector lentiviral que expresa GFP, las células GFP-positivas fueron aproximadamente 30%Cuando confluentes, la densidad esperada de los cultivos fue de alrededor de 2 millones de células por mililitro.
Se observó aproximadamente un 50% de muerte celular dentro de las primeras 24 a 48 horas antes de que se realizara el primer cambio medio. Después de una semana, sin embargo, el número de células volvió al 80 al 100% del número de células sembradas. Los cambios precisos en los medios utilizando medios frescos y precalentados son fundamentales para la estabilidad a largo plazo de este método de cultivo HSC.
Desde que se publicó el método original en 2019, el campo ha comenzado a usarlo de diferentes maneras para estudiar la biología de HSC.
