私たちのプロトコルは、生物学的部分間の関係をより簡単かつ迅速に理解します。1つのウェル内の部品の多くの比率メトリックの組み合わせの動作をテストできます。この手法により、研究者は回路コンポーネント間の複雑な関係をより包括的に特徴付け、従来のアプローチよりも高い実験効率で特徴付けることができます。
この方法は、合成生物学や生物学的な問題に適用でき、フローサイトメトリーで出力を測定できるさまざまなレベルのトランスフェクト遺伝子に応答して細胞の行動変化を調べます。カラーコントロールなし、mKO2コントロール、TagBFPコントロール、ネオングリーンコントロール、オールカラーコントロール、ポリトランスフェクションミックス1、ポリトランスフェクションミックス2とラベル付けされた1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブを確保して、各DNA凝集体用のチューブの準備を開始します。36マイクロリットルの還元血清培地をノーカラーコントロール、mKO2コントロール、TagBFPコントロール、ネオングリーンコントロール、およびすべてのカラーコントロールチューブに加え、18マイクロリットルの還元血清培地を各ポリトランスフェクションミックス1本およびポリトランスフェクションミックス2本のチューブに加えます。
次に、600ナノグラムのフィラープラスミドをノーカラーコントロールチューブに、300ナノグラムのmKO2と300ナノグラムのフィラープラスミドをmKO2カラーコントロールチューブに、300ナノグラムのTagBFPと300ナノグラムのフィラープラスミドをTagBFPカラーコントロールチューブに追加します。ネオングリーンカラーコントロールチューブに、300ナノグラムの構成ネオングリーンと300ナノグラムのフィラープラスミドを追加し、次に各mKO2、TagBFP、構成ネオングリーン、および300ナノグラムのフィラープラスミドを100ナノグラムをオールカラーコントロールチューブに追加します。ポリトランスフェクションミックス1本のチューブに、150ナノグラムのmKO2、75ナノグラムのレポーターネオングリーンプラスミド、75ナノグラムのフィラープラスミドを加えます。
ポリトランスフェクションミックス2本のチューブに、150ナノグラムのTagBFP、75ナノグラムのL7Aeプラスミド、および75ナノグラムのフィラープラスミドを加えます。完了したら、216マイクロリットルの還元血清培地と9.48マイクロリットルのトランスフェクション試薬を組み合わせて、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブでトランスフェクションマスターミックスを作成します。脇に置く前に、上下にピペッティングしてよく混ぜます。
1.58マイクロリットルのエンハンサー試薬をカラーコントロールなし、シングルカラーコントロール、およびすべてのカラーコントロールチューブに追加し、79マイクロリットルのエンハンサー試薬を各ポリトランスフェクションミックスチューブに追加します。激しくピペッティングして各チューブを個別に混合します。37.58マイクロリットルのトランスフェクションマスターミックスをカラーコントロールなし、シングルカラーコントロール、およびオールカラーコントロールチューブに加え、激しくピペッティングして混合します。
次に、18.79マイクロリットルのトランスフェクションマスターミックスを各ポリトランスフェクションミックスチューブに加え、各チューブを激しいピペッティングでよく混合します。無色、単色、およびすべてのカラーコントロールの各トランスフェクションミックス65.97マイクロリットルを対応するウェルにピペッティングしてトランスフェクションミックスを分注し、次に32.98マイクロリットルのポリトランスフェクションミックス1をポリトランスフェクションウェルに移し、プレートを素早く、しかし穏やかにタイトに旋回させることによって複合体を効果的に分配します。 平坦な表面に沿ってフィギュレートパターンを作成し、32.98マイクロリットルのポリトランスフェクションミックス2つを同じポリトランスフェクションウェルにピペットで入れ、同じ方法でプレートを旋回させます。細胞を2日間インキュベートします。
フローサイトメトリーを実行して、トランスフェクションマーカーの蛍光を読み取り、各細胞のレポーターを出力します。ビデオに示されているポリトランスフェクションとは異なり、良好に実行されたコトランスフェクションは、TagBFPとEYFPの間に密接な相関関係を示し、コデリバリーされたプラスミドを発現します。対照的に、コトランスフェクションが不十分な場合、2つのプラスミド間の相関性は低くなります。
良好に実行されたポリトランスフェクションは、2次元空間の良好なカバレッジと、蛍光タンパク質間のスペクトルブリードの良好な補償を示しました。生細胞数が少ないポリトランスフェクションデータは、解析のために各ビンに十分な数の細胞がある十分なビンに細分化することは困難でした。トランスフェクション効率の低いポリトランスフェクションでは、分析用の2次元空間のカバレッジがまばらでした。
出力発現に対する有効なDNA比は、リプレッサータンパク質L7AeとmKO2、および出力タンパク質ネオングリーンとTagBFPを別々のトランスフェクションミックスに入れることによってテストされました。次に、ネオングリーンの発現をmKO2およびTagBFPの異なるレベルでモニターした。この回路について、コトランスフェクションとポリトランスフェクションの結果を比較しました。
前に示したDNA部分を組み合わせた11の個別のコトランスフェクションの結果を1つのデータセットに照合し、ポリトランスフェクションデータと比較しました。アウトプットレポーターを抑制したL7Aeの用量反応曲線を比較すると、ビンあたりのアウトプットレベルの中央値は、コトランスフェクションデータとポリトランスフェクションデータの間で非常に類似していることが示されました。細胞型分類器を最適化するためのポリトランスフェクションの適用の成功が実証されました。
HeLa細胞と非HEK細胞に存在するマイクロRNA-21は、BM3R1が回路出力mKO2の産生を抑制するため、BM3R1の発現をノックダウンするように作用します。マイクロRNA21が細胞内に存在する場合、mKO2発現がオンになります。Gal4-VP16の量は、BM3R1の低レベルでmKO2発現を調整します。
各回路部品は、異なる蛍光マーカーと同時送達されました。このポリトランスフェクションは、各細胞が各回路成分をどれだけ受けたかを定量化します。mKO2はMIR21で産生され、HeLa細胞を産生するが、HEK細胞では産生しない。
mKO2出力は、これらの回路成分を個別の蛍光レポーターを用いた個別のトランスフェクションミックスで送達した後に分析し、特定の細胞が受容した各回路成分の量を示しました。このサブサンプリングでは、HEK293細胞とHeLa細胞を分類した場合、この比率で、共トランスフェクトされた回路の特異性は91%、感度は62%、精度は77%であると予測されました。このプロトコルで最も一般的な問題点は、各トランスフェクションミックス内に厳密な相関関係がないことです。
したがって、エンハンサー試薬を添加した直後にトランスフェクションチューブを激しく混合し、脂質含有トランスフェクションミックスを添加した後、トランスフェクションチューブの混合とピペッティングを穏やかにすることを忘れないでくださいこの手順の遺伝的構成要素は、さまざまな環境での機能性能に関する質問に答えるために、他の遺伝的成分に置き換えることができます。この方法は、細胞分類器、フィードバックおよびフィードフォワードコントローラー、双安定モチーフなどの遺伝子回路を急速に開発してきました。
