Nuestro protocolo hace que sea más fácil y rápido entender las relaciones entre las partes biológicas. Podemos probar el comportamiento de muchas combinaciones métricas de proporción de partes en un solo pozo. Esta técnica permite a los investigadores caracterizar las complejas relaciones entre los componentes del circuito de manera más exhaustiva con una mayor eficiencia experimental que los enfoques convencionales.
Este método es aplicable para la biología sintética y para cualquier pregunta biológica, sondeando cambios de comportamiento en una célula en respuesta a diferentes niveles de genes transfectados donde la salida se puede medir a través de citometría de flujo. Comience a preparar tubos para cada agregado de ADN reservando tubos de microcentrífuga de 1.5 mililitros etiquetados como sin control de color, control mKO2, control TagBFP, control verde neón, control de todo color, mezcla de politransfección uno y mezcla de politransfección dos. Agregue 36 microlitros de medio sérico reducido al control sin color, control mKO2, control TagBFP, control verde neón y todos los tubos de control de color, luego agregue 18 microlitros de medio sérico reducido a cada mezcla de politransfección uno y mezcla de politransfección dos tubos.
A continuación, agregue 600 nanogramos de plásmido de relleno al tubo de control sin color, 300 nanogramos de mKO2 y 300 nanogramos de plásmido de relleno al tubo de control de color mKO2 y agregue 300 nanogramos de TagBFP y 300 nanogramos de plásmido de relleno al tubo de control de color TagBFP. Al tubo de control de color verde neón, agregue 300 nanogramos de verde neón constitutivo y 300 nanogramos de plásmido de relleno, luego agregue 100 nanogramos de cada mKO2, TagBFP, verde neón constitutivo y 300 nanogramos de plásmido de relleno al tubo de control de todo color. A la mezcla de poli-transfección un tubo, agregue 150 nanogramos de mKO2, 75 nanogramos de plásmido verde neón reportero y 75 nanogramos de plásmido de relleno.
A la mezcla de poli-transfección de dos tubos, agregue 150 nanogramos de TagBFP, 75 nanogramos de plásmido L7Ae y 75 nanogramos de plásmido de relleno. Una vez hecho esto, cree la mezcla maestra de transfección en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros combinando 216 microlitros de medio sérico reducido con 9,48 microlitros de reactivo de transfección. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo antes de reservar.
Agregue 1.58 microlitros de reactivo potenciador sin control de color, control de color único y todos los tubos de control de color y agregue 79 microlitros de reactivo potenciador a cada tubo de mezcla de politransfección. Mezclar cada tubo individualmente pipeteando vigorosamente. Agregue 37.58 microlitros de mezcla maestra de transfección a los tubos sin control de color, control de color único y todos los tubos de control de color y mezcle pipeteando vigorosamente.
A continuación, agregue 18.79 microlitros de mezcla maestra de transfección a cada tubo de mezcla de politransfección y mezcle bien cada tubo con un pipeteo vigoroso. Dispense las mezclas de transfección en los pocillos pipeteando 65.97 microlitros de cada mezcla de transfección para los controles sin color, de un solo color y de todo el color en los pocillos correspondientes, luego transfiera 32.98 microlitros de la mezcla de politransfección uno al pozo de politransfección y distribuya los complejos de manera efectiva girando la placa rápida pero suavemente en un apretado, Calcule el patrón a lo largo de una superficie plana, luego pipete 32.98 microlitros de la poli-transfección mezcle dos en el mismo pocillo de poli-transfección y gire la placa de la misma manera. Incubar las células durante dos días.
Realice citometría de flujo para leer la fluorescencia de los marcadores de transfección y el reportero de salida para cada célula. Una co-transfección bien realizada, distinta de la poli-transfección que se muestra en el video, muestra una estrecha correlación entre TagBFP y EYFP, expresando plásmidos que fueron co-entregados. En contraste, una co-transfección mal realizada muestra una correlación pobre entre los dos plásmidos.
La politransfección bien realizada mostró una buena cobertura del espacio bidimensional y una buena compensación de cualquier sangrado espectral entre las proteínas fluorescentes. Los datos de politransfección con un bajo número de células vivas fueron difíciles de subdividir en suficientes contenedores con un número suficiente de células en cada contenedor para el análisis. Una politransfección con poca eficiencia de transfección dio como resultado una cobertura dispersa del espacio bidimensional para el análisis.
La relación efectiva de ADN en la expresión de salida se probó colocando una proteína represora, L7Ae con mKO2, y una proteína de salida, verde neón con TagBFP, en mezclas de transfección separadas. La expresión verde neón fue monitoreada en diferentes niveles de mKO2 y TagBFP. Los resultados de co-transfección y poli-transfección se compararon para este circuito.
Los resultados de 11 cotransfecciones individuales que combinaron las partes de ADN mostradas anteriormente se recopilaron en un solo conjunto de datos y se compararon con los datos de politransfección. La comparación de las curvas de dosis-respuesta de L7Ae que reprimían el reportero de salida mostró que el nivel medio de salida por contenedor era muy similar entre los datos de co-transfección y poli-transfección. Se demostró una aplicación exitosa de politransfección para optimizar un clasificador de tipo celular.
El micro ARN-21 presente en las células HeLa y las células no-HEK actúa para derribar la expresión de BM3R1 porque BM3R1 reprime la producción de la salida del circuito mKO2. Cuando el micro ARN 21 está presente en una célula, se activará la expresión de mKO2. La cantidad de Gal4-VP16 sintoniza la expresión de mKO2 a niveles bajos de BM3R1.
Cada componente del circuito fue entregado conjuntamente con un marcador fluorescente diferente. Esta politransfección cuantifica la cantidad de cada componente del circuito que recibió cada célula. mKO2 se produce en MIR21, produciendo células HeLa pero no en células HEK.
La salida de mKO2 se analizó después de entregar estos componentes del circuito en mezclas de transfección separadas con distintos reporteros fluorescentes para indicar la cantidad de cada componente del circuito recibido por una celda en particular. Este submuestreo predijo que en esta relación, el circuito cotransfectado tenía una especificidad del 91%, una sensibilidad del 62% y una precisión del 77%, al clasificar HEK293 versus células HeLa. El punto de dolor más común en este protocolo es la falta de una correlación estrecha dentro de cada mezcla de transfección.
Así que recuerde mezclar vigorosamente los tubos de transfección justo después de agregar el reactivo potenciador y luego sea suave con la mezcla y pipeteo de los tubos de transfección después de agregar la mezcla de transfección que contiene lípidos Los componentes genéticos en este procedimiento podrían reemplazarse con cualquier otro componente genético para responder preguntas sobre su rendimiento funcional en diversos entornos. Este método ha desarrollado rápidamente circuitos genéticos, como clasificadores celulares, controladores de retroalimentación y feedforward, motivos biestables y muchos más.
