Unser Protokoll macht es einfacher und schneller, Beziehungen zwischen biologischen Teilen zu verstehen. Wir können das Verhalten vieler ratiometrischer Kombinationen von Teilen in einer einzigen Vertiefung testen. Diese Technik ermöglicht es den Forschern, die komplexen Beziehungen zwischen Schaltungskomponenten umfassender und experimenteller effizienter zu charakterisieren als herkömmliche Ansätze.
Diese Methode ist für die synthetische Biologie und für alle biologischen Fragestellungen anwendbar, um Verhaltensänderungen in einer Zelle als Reaktion auf verschiedene Konzentrationen transfizierter Gene zu untersuchen, wobei der Output mittels Durchflusszytometrie gemessen werden kann. Beginnen Sie mit der Vorbereitung von Röhrchen für jedes DNA-Aggregat, indem Sie 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen beiseite legen, die als keine Farbkontrolle, mKO2-Kontrolle, TagBFP-Kontrolle, Neongrün-Kontrolle, alle Farbkontrolle, Poly-Transfektionsmischung eins und Poly-Transfektionsmischung zwei gekennzeichnet sind. Geben Sie 36 Mikroliter reduziertes Serummedium in die No-Color-Control-, mKO2-Control-, TagBFP-Control-, Neongrün-Control- und alle Color-Control-Röhrchen und geben Sie dann 18 Mikroliter reduziertes Serummedium zu jeder Poly-Transfektionsmischung und jeder Poly-Transfektionsmischung zu zwei Röhrchen.
Als nächstes geben Sie 600 Nanogramm Füllstoffplasmid in das Farbkontrollröhrchen ohne Farbe, 300 Nanogramm mKO2 und 300 Nanogramm Füllstoffplasmid in das mKO2-Farbkontrollröhrchen und geben Sie 300 Nanogramm TagBFP und 300 Nanogramm Füllstoffplasmid in das TagBFP-Farbkontrollröhrchen. Fügen Sie dem neongrünen Farbkontrollröhrchen 300 Nanogramm konstitutives Neongrün und 300 Nanogramm Füllstoffplasmid hinzu, dann fügen Sie 100 Nanogramm jedes mKO2, TagBFP, konstitutiven Neongrün und 300 Nanogramm Füllstoffplasmid in das Vollfarbkontrollröhrchen hinzu. Fügen Sie der Polytransfektionsmischung ein Röhrchen hinzu, fügen Sie 150 Nanogramm mKO2, 75 Nanogramm Reporter-Neongrün-Plasmid und 75 Nanogramm Füllstoffplasmid hinzu.
Fügen Sie der Polytransfektionsmischung zwei Röhrchen 150 Nanogramm TagBFP, 75 Nanogramm L7Ae-Plasmid und 75 Nanogramm Füllstoffplasmid hinzu. Sobald Sie fertig sind, stellen Sie die Transfektions-Mastermischung in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen her, indem Sie 216 Mikroliter reduziertes Serummedium mit 9,48 Mikrolitern Transfektionsreagenz kombinieren. Mischen Sie gut, indem Sie es auf und ab pipettieren, bevor Sie es beiseite stellen.
Fügen Sie 1,58 Mikroliter Enhancer-Reagenz zu No-Color-Control-, Single-Color-Control- und allen Color-Control-Röhrchen hinzu und fügen Sie 79 Mikroliter Enhancer-Reagenz zu jedem Poly-Transfektions-Mix-Röhrchen hinzu. Mischen Sie jedes Röhrchen einzeln, indem Sie kräftig pipettieren. Geben Sie 37,58 Mikroliter Transfektions-Mastermix in die No-Color-Control-, Single-Color-Control- und All-Color-Control-Röhrchen und mischen Sie sie durch kräftiges Pipettieren.
Als nächstes geben Sie 18,79 Mikroliter Transfektions-Mastermix in jedes Poly-Transfektions-Mix-Röhrchen und mischen Sie jedes Röhrchen gut mit kräftigem Pipettieren. Dosieren Sie die Transfektionsmischungen in die Vertiefungen, indem Sie 65,97 Mikroliter jeder Transfektionsmischung für die farblose, einfarbige und alle Farbkontrollen in die entsprechenden Vertiefungen pipettieren, dann 32,98 Mikroliter der Polytransfektionsmischung eins in die Polytransfektionsvertiefung geben und die Komplexe effektiv verteilen, indem die Platte schnell, aber schonend in einer dichten, Bilden Sie ein Muster entlang einer ebenen Oberfläche, pipettieren Sie dann 32,98 Mikroliter der Poly-Transfektionsmischung in dieselbe Poly-Transfektionsvertiefung und schwenken Sie die Platte auf die gleiche Weise. Inkubieren Sie die Zellen zwei Tage lang.
Führen Sie eine Durchflusszytometrie durch, um die Fluoreszenz der Transfektionsmarker auszulesen und den Reporter für jede Zelle auszugeben. Eine gut durchgeführte Co-Transfektion, die sich von der im Video gezeigten Poly-Transfektion unterscheidet, zeigt eine enge Korrelation zwischen TagBFP und EYFP, wobei Plasmide exprimiert werden, die gemeinsam abgegeben wurden. Im Gegensatz dazu zeigt eine schlecht durchgeführte Co-Transfektion eine schlechte Korrelation zwischen den beiden Plasmiden.
Die gut durchgeführte Polytransfektion zeigte eine gute Abdeckung des zweidimensionalen Raums und eine gute Kompensation des spektralen Durchschlagens zwischen fluoreszierenden Proteinen. Polytransfektionsdaten mit einer geringen Anzahl lebender Zellen ließen sich nur schwer in genügend Bins mit einer ausreichenden Anzahl von Zellen in jedem Bins für die Analyse unterteilen. Eine Polytransfektion mit schlechter Transfektionseffizienz führte zu einer spärlichen Abdeckung des zweidimensionalen Raums für die Analyse.
Das effektive DNA-Verhältnis bei der Output-Expression wurde getestet, indem ein Repressorprotein, L7Ae mit mKO2, und ein Output-Protein, neongrün mit TagBFP, in separate Transfektionsmischungen platziert wurden. Die neongrüne Expression wurde dann in verschiedenen Konzentrationen von mKO2 und TagBFP überwacht. Die Ergebnisse der Co-Transfektion und der Poly-Transfektion wurden für diese Schaltung verglichen.
Die Ergebnisse von 11 einzelnen Co-Transfektionen, die die zuvor gezeigten DNA-Teile kombinierten, wurden in einem einzigen Datensatz zusammengefasst und mit den Poly-Transfektionsdaten verglichen. Der Vergleich der Dosis-Wirkungs-Kurven von L7Ae unter Unterdrückung des Output-Reporters zeigte, dass der mediane Output-Pegel pro Bin zwischen den Co-Transfektions- und Poly-Transfektionsdaten sehr ähnlich war. Eine erfolgreiche Anwendung der Polytransfektion zur Optimierung eines Zelltypklassifikators wurde demonstriert.
Die Mikro-RNA-21, die in HeLa-Zellen und Nicht-HEK-Zellen vorhanden ist, unterdrückt die Expression von BM3R1, da BM3R1 die Produktion des Schaltkreisausgangs mKO2 unterdrückt. Wenn micro RNA 21 in einer Zelle vorhanden ist, wird die mKO2-Expression aktiviert. Die Menge an Gal4-VP16 stimmt die mKO2-Expression bei niedrigen Pegeln von BM3R1 ab.
Jede Schaltungskomponente wurde mit einem anderen Fluoreszenzmarker geliefert. Diese Polytransfektion quantifiziert, wie viel von jeder Schaltungskomponente jede Zelle erhalten hat. mKO2 wird in MIR21 produziert und produziert HeLa-Zellen, aber nicht in HEK-Zellen.
Die mKO2-Ausgabe wurde analysiert, nachdem diese Schaltungskomponenten in separaten Transfektionsmischungen mit unterschiedlichen Fluoreszenzreportern geliefert wurden, um die Menge jeder Schaltungskomponente anzugeben, die von einer bestimmten Zelle empfangen wurde. Diese Teilprobenahme prognostizierte, dass der co-transfizierte Schaltkreis bei diesem Verhältnis eine Spezifität von 91 %, eine Sensitivität von 62 % und eine Genauigkeit von 77 % bei der Klassifizierung von HEK293 im Vergleich zu HeLa-Zellen aufwies. Der häufigste Schmerzpunkt in diesem Protokoll ist das Fehlen einer engen Korrelation innerhalb jeder Transfektionsmischung.
Denken Sie also daran, die Transfektionsröhrchen direkt nach der Zugabe des Enhancer-Reagenzes kräftig zu mischen und dann vorsichtig mit dem Mischen und Pipettieren der Transfektionsröhrchen umzugehen, nachdem die lipidhaltige Transfektionsmischung hinzugefügt wurde. Die genetischen Komponenten in diesem Verfahren können durch andere genetische Komponenten ersetzt werden, um Fragen zu ihrer Funktionsfähigkeit in verschiedenen Umgebungen zu beantworten. Diese Methode hat schnell genetische Schaltkreise entwickelt, wie z.B. Zellklassifikatoren, Rückkopplungs- und Feedforward-Controller, bistabile Motive und vieles mehr.
