Наш протокол упрощает и ускоряет понимание взаимосвязей между биологическими частями. Мы можем проверить поведение многих метрических комбинаций деталей в одной скважине. Этот метод позволяет исследователям более всесторонне охарактеризовать сложные взаимосвязи между компонентами схемы с большей экспериментальной эффективностью, чем традиционные подходы.
Этот метод применим для синтетической биологии и для любых биологических вопросов, исследуя поведенческие изменения в клетке в ответ на различные уровни трансфицированных генов, где выход может быть измерен с помощью проточной цитометрии. Начните подготовку пробирок для каждого агрегата ДНК, отложив в сторону 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки, помеченные как без контроля цвета, контроль mKO2, контроль TagBFP, неоново-зеленый контроль, контроль цвета, смесь политрансфекции один и смесь политрансфекции два. Добавьте 36 микролитров восстановленной сывороточной среды в контрольную камеру без цвета, контроль mKO2, контроль TagBFP, неоново-зеленый контроль и все пробирки контроля цвета, затем добавьте 18 микролитров восстановленной сыворотки в каждую политрансфекционную смесь одну и политрансфекционную смесь в две пробирки.
Затем добавьте 600 нанограммов плазмиды-наполнителя в пробирку без контроля цвета, 300 нанограммов mKO2 и 300 нанограммов плазмиды-наполнителя в цветную контрольную трубку mKO2 и добавьте 300 нанограммов TagBFP и 300 нанограммов плазмиды-наполнителя в пробирку для контроля цвета TagBFP. К контрольной трубке неоново-зеленого цвета добавьте 300 нанограммов конститутивного неоново-зеленого и 300 нанограммов плазмиды-наполнителя, затем добавьте 100 нанограммов каждого mKO2, TagBFP, составляющего неоново-зеленого и 300 нанограммов плазмиды-наполнителя ко всем цветным контрольным трубкам. К политрансфекционной смеси в одну пробирку добавляют 150 нанограммов мКО2, 75 нанограммов репортерной неоново-зеленой плазмиды и 75 нанограммов плазмиды-наполнителя.
К смеси политрансфекции из двух пробирок добавьте 150 нанограммов TagBFP, 75 нанограммов плазмиды L7Ae и 75 нанограммов плазмиды-наполнителя. После этого создайте мастер-смесь для трансфекции в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 миллилитра, объединив 216 микролитров восстановленной сывороточной среды с 9,48 микролитрами реагента для трансфекции. Хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз, прежде чем отложить в сторону.
Добавьте 1,58 микролитра реагента-усилителя без контроля цвета, одного контроля цвета и всех пробирок контроля цвета и добавьте 79 микролитров реагента-усилителя в каждую пробирку смеси для политрансфекции. Смешайте каждую трубку по отдельности, энергично пипетируя. Добавьте 37,58 микролитров мастер-смеси для трансфекции в пробирки без контроля цвета, одноцветного контроля и все контрольные трубки цвета и энергично перемешайте.
Затем добавьте 18,79 микролитров смеси для трансфекции в каждую пробирку смеси для политрансфекции и хорошо перемешайте каждую пробирку с помощью энергичного пипетирования. Распределите смеси для трансфекции в лунки путем пипетирования 65,97 микролитров каждой смеси для трансфекции для контроля без цвета, одного цвета и всех цветов в соответствующие лунки, затем перенесите 32,98 микролитра смеси для политрансфекции один в лунку для политрансфекции и эффективно распределите комплексы, быстро, но осторожно вращая пластину в плотном положении, Нарисуйте узор вдоль плоской поверхности, затем наберите пипеткой 32,98 микролитра политрансфекции, смешайте два в одну и ту же лунку для политрансфекции и закрутите пластину таким же образом. Инкубируют клетки в течение двух суток.
Проведите проточную цитометрию, чтобы считывать флуоресценцию маркеров трансфекции и выходной репортер для каждой клетки. Хорошо выполненная совместная трансфекция, отличная от политрансфекции, показанной на видео, показывает тесную корреляцию между TagBFP и EYFP, экспрессирующими плазмиды, которые были доставлены совместно. Напротив, плохо выполненная котрансфекция показывает плохую корреляцию между двумя плазмидами.
Хорошо выполненная политрансфекция показала хороший охват двумерного пространства и хорошую компенсацию любого спектрального кровотечения между флуоресцентными белками. Данные политрансфекции с небольшим количеством живых клеток было трудно разделить на достаточное количество ячеек с достаточным количеством клеток в каждой ячейке для анализа. Политрансфекция с низкой эффективностью трансфекции привела к разреженному охвату двумерного пространства для анализа.
Эффективное соотношение ДНК на выходной экспрессии было проверено путем помещения белка-репрессора L7Ae с mKO2 и выходного белка, неоново-зеленого с TagBFP, в отдельные смеси для трансфекции. Затем экспрессию неонового зеленого цвета контролировали на разных уровнях mKO2 и TagBFP. Результаты котрансфекции и политрансфекции сравнивались для этой схемы.
Результаты 11 отдельных совместных трансфекций, которые объединили части ДНК, показанные ранее, были собраны в единый набор данных и сравнены с данными политрансфекции. Сравнение кривых доза-реакция L7Ae, подавляющего выходной репортер, показало, что медианный выходной уровень на ячейку был очень похож между данными о совместной трансфекции и политрансфекции. Было продемонстрировано успешное применение политрансфекции для оптимизации классификатора типов клеток.
Микро-РНК-21, присутствующая в клетках HeLa и не-HEK-клетках, подавляет экспрессию BM3R1, поскольку BM3R1 подавляет выработку выходного сигнала схемы mKO2. Когда микро-РНК 21 присутствует в клетке, экспрессия mKO2 включается. Количество Gal4-VP16 настраивает экспрессию mKO2 на низких уровнях BM3R1.
Каждый компонент схемы был доставлен вместе с другим флуоресцентным маркером. Эта политрансфекция количественно определяет, сколько каждого компонента цепи получила каждая ячейка. mKO2 продуцируется в MIR21, продуцируя клетки HeLa, но не в клетках HEK.
Выход mKO2 был проанализирован после доставки этих компонентов схемы в отдельных трансфекционных смесях с различными флуоресцентными репортерами, чтобы указать количество каждого компонента схемы, полученного конкретной ячейкой. Эта подвыборка предсказала, что при таком соотношении котрансфицированная цепь имела 91% специфичности, 62% чувствительности и 77% точности при классификации HEK293 по сравнению с клетками HeLa. Наиболее распространенной болевой точкой в этом протоколе является отсутствие тесной корреляции внутри каждой смеси трансфекции.
Поэтому не забывайте энергично перемешивать трубки для трансфекции сразу после добавления реагента-усилителя, а затем будьте осторожны с перемешиванием и пипетированием трубок для трансфекции после добавления смеси для трансфекции, содержащей липиды. Этот метод быстро развил генетические схемы, такие как классификаторы клеток, контроллеры обратной связи и прямой связи, бистабильные мотивы и многое другое.
