Nosso protocolo facilita e agiliza o entendimento das relações entre as partes biológicas. Podemos testar o comportamento de muitas combinações métricas de razão de peças em um único poço. Esta técnica permite aos pesquisadores caracterizar as complexas relações entre os componentes do circuito de forma mais abrangente com maior eficiência experimental do que as abordagens convencionais.
Este método é aplicável para biologia sintética e para quaisquer questões biológicas, investigando mudanças comportamentais em uma célula em resposta a diferentes níveis de genes transfectados onde o débito pode ser medido via citometria de fluxo. Comece a preparar tubos para cada agregado de DNA reservando tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro rotulados como sem controle de cor, controle mKO2, controle TagBFP, controle verde neon, controle de todas as cores, mistura de politransfecção um e mistura de politransfecção dois. Adicione 36 microlitros de meio de soro reduzido ao controle sem cor, controle mKO2, controle TagBFP, controle verde neon e todos os tubos de controle de cor, em seguida, adicione 18 microlitros de meio de soro reduzido a cada mistura de politransfecção um e mistura de politransfecção dois tubos.
Em seguida, adicione 600 nanogramas de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle sem cor, 300 nanogramas de mKO2 e 300 nanogramas de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle de cor mKO2 e adicione 300 nanogramas de TagBFP e 300 nanogramas de plasmídeo de preenchimento ao tubo de controle de cor TagBFP. Ao tubo de controle de cor verde neon, adicione 300 nanogramas de verde neon constitutivo e 300 nanogramas de plasmídeo de carga, em seguida, adicione 100 nanogramas de cada mKO2, TagBFP, verde neon constitutivo e 300 nanogramas de plasmídeo de enchimento ao tubo de controle de todas as cores. Para a mistura de politransfecção um tubo, adicione 150 nanogramas de mKO2, 75 nanogramas de plasmídeo verde neon repórter e 75 nanogramas de plasmídeo de preenchimento.
Para a mistura de politransfecção dois tubos, adicione 150 nanogramas de TagBFP, 75 nanogramas de plasmídeo L7Ae e 75 nanogramas de plasmídeo de enchimento. Uma vez feito, crie a mistura mestre de transfecção em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro combinando 216 microlitros de meio de soro reduzido com 9,48 microlitros de reagente de transfecção. Misture bem pipetando para cima e para baixo antes de colocá-lo de lado.
Adicione 1,58 microlitros de reagente intensificador sem controle de cor, controle de cor única e todos os tubos de controle de cor e adicione 79 microlitros de reagente intensificador a cada tubo de mistura de politransfecção. Misture cada tubo individualmente pipetando vigorosamente. Adicione 37,58 microlitros de mistura mestre de transfecção ao controle sem cor, controle de cor única e todos os tubos de controle de cor e misture pipetando vigorosamente.
Em seguida, adicione 18,79 microlitros de mistura mestre de transfecção a cada tubo de mistura de politransfecção e misture bem cada tubo com pipetagem vigorosa. Distribua as misturas de transfecção nos poços pipetando 65,97 microlitros de cada mistura de transfecção para os controles sem cor, cor única e todas as cores para os poços correspondentes, em seguida, transfira 32,98 microlitros da mistura de politransfecção um para o poço de politransfecção e distribua os complexos de forma eficaz, girando a placa rapidamente, mas suavemente em um apertado, Figurar padrão ao longo de uma superfície plana, em seguida, pipetar 32,98 microlitros da poli-transfecção misturar dois no mesmo poço de poli-transfecção e girar a placa da mesma maneira. Incubar as células por dois dias.
Realizar citometria de fluxo para ler a fluorescência dos marcadores de transfecção e o repórter de saída para cada célula. Uma co-transfecção bem realizada, distinta da poli-transfecção mostrada no vídeo, mostra uma estreita correlação entre TagBFP e EYFP, expressando plasmídeos que foram co-entregues. Em contraste, uma co-transfecção mal realizada mostra uma fraca correlação entre os dois plasmídeos.
A politransfecção bem realizada mostrou boa cobertura do espaço bidimensional e boa compensação de qualquer sangramento espectral entre proteínas fluorescentes. Os dados de politransfecção com um baixo número de células vivas foram difíceis de subdividir em compartimentos suficientes com um número suficiente de células em cada silo para análise. Uma politransfecção com baixa eficiência de transfecção resultou em cobertura esparsa do espaço bidimensional para análise.
A razão efetiva do DNA na expressão de saída foi testada colocando-se uma proteína repressora, L7Ae com mKO2, e uma proteína de saída, verde neon com TagBFP, em misturas de transfecção separadas. A expressão do verde de néon foi então monitorada em diferentes níveis de mKO2 e TagBFP. Os resultados de co-transfecção e politransfecção foram comparados para este circuito.
Os resultados de 11 co-transfecções individuais que combinaram as partes de DNA mostradas anteriormente foram agrupados em um único conjunto de dados e comparados com os dados de politransfecção. A comparação das curvas dose-resposta de L7Ae reprimindo o repórter de saída mostrou que o nível mediano de saída por silo foi muito semelhante entre os dados de co-transfecção e politransfecção. Uma aplicação bem sucedida de poli-transfecção foi demonstrada para otimizar um classificador de tipo celular.
O micro RNA-21 presente nas células HeLa e não-HEK atua para derrubar a expressão de BM3R1 porque BM3R1 reprime a produção do circuito de saída mKO2. Quando o micro RNA 21 está presente em uma célula, a expressão de mKO2 será ativada. A quantidade de Gal4-VP16 sintoniza a expressão de mKO2 em baixos níveis de BM3R1.
Cada componente do circuito foi co-entregue com um marcador fluorescente diferente. Essa politransfecção quantifica quanto de cada componente do circuito cada célula recebeu. O mKO2 é produzido em MIR21, produzindo células HeLa, mas não em células HEK.
A saída de mKO2 foi analisada após a entrega desses componentes de circuito em misturas de transfecção separadas com repórteres fluorescentes distintos para indicar a quantidade de cada componente do circuito recebido por uma determinada célula. Essa subamostragem previu que, nessa proporção, o circuito co-transfectado apresentou especificidade de 91%, sensibilidade de 62% e acurácia de 77%, ao classificar células HEK293 versus células HeLa. O ponto de dor mais comum neste protocolo é a falta de uma correlação estreita dentro de cada mistura de transfecção.
Portanto, lembre-se de misturar vigorosamente os tubos de transfecção logo após a adição do reagente intensificador e, em seguida, ser suave com a mistura e pipetagem dos tubos de transfecção depois que a mistura de transfecção contendo lipídios for adicionada Os componentes genéticos neste procedimento podem ser substituídos por quaisquer outros componentes genéticos para responder a perguntas sobre seu desempenho funcional em vários ambientes. Este método desenvolveu rapidamente circuitos genéticos, tais como classificadores de células, controladores de feedback e feedforward, motivos bi-estáveis e muito mais.
