Il nostro protocollo rende più facile e veloce comprendere le relazioni tra le parti biologiche. Possiamo testare il comportamento di molte combinazioni metriche di rapporto di parti in un singolo pozzetto. Questa tecnica consente ai ricercatori di caratterizzare le complesse relazioni tra i componenti del circuito in modo più completo con una maggiore efficienza sperimentale rispetto agli approcci convenzionali.
Questo metodo è applicabile per la biologia sintetica e per qualsiasi questione biologica, sondando i cambiamenti comportamentali in una cellula in risposta a diversi livelli di geni trasfettati in cui l'output può essere misurato tramite citometria a flusso. Inizia a preparare i tubi per ogni aggregato di DNA mettendo da parte le provette da micro centrifuga da 1,5 millilitri etichettate come nessun controllo del colore, controllo mKO2, controllo TagBFP, controllo verde neon, controllo di tutti i colori, mix di poli-trasfezione uno e mix di poli-trasfezione due. Aggiungere 36 microlitri di mezzo sierico ridotto al controllo senza colore, al controllo mKO2, al controllo TagBFP, al controllo verde neon e a tutti i tubi di controllo del colore, quindi aggiungere 18 microlitri di mezzo sierico ridotto a ciascun mix di poli-trasfezione uno e il mix di poli-trasfezione due tubi.
Quindi, aggiungere 600 nanogrammi di plasmide di riempimento al tubo di controllo senza colore, 300 nanogrammi di mKO2 e 300 nanogrammi di plasmide di riempimento al tubo di controllo del colore mKO2 e aggiungere 300 nanogrammi di TagBFP e 300 nanogrammi di plasmide di riempimento al tubo di controllo del colore TagBFP. Al tubo di controllo del colore verde neon, aggiungere 300 nanogrammi di verde neon costitutivo e 300 nanogrammi di plasmide di riempimento, quindi aggiungere 100 nanogrammi di ogni mKO2, TagBFP, verde neon costitutivo e 300 nanogrammi di plasmide di riempimento al tubo di controllo di tutti i colori. Alla miscela di poli-trasfezione un tubo, aggiungere 150 nanogrammi di mKO2, 75 nanogrammi di plasmide verde neon reporter e 75 nanogrammi di plasmide di riempimento.
Al mix di poli-trasfezione due tubi, aggiungere 150 nanogrammi di TagBFP, 75 nanogrammi di plasmide L7Ae e 75 nanogrammi di plasmide di riempitivo. Una volta fatto, creare la miscela master di trasfezione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri combinando 216 microlitri di mezzo sierico ridotto con 9,48 microlitri di reagente di trasfezione. Mescolare bene pipettando su e giù prima di metterlo da parte.
Aggiungere 1,58 microlitri di reagente enhancer a nessun controllo del colore, controllo del colore singolo e tutti i tubi di controllo del colore e aggiungere 79 microlitri di reagente enhancer a ciascun tubo di mix di poli-trasfezione. Mescolare ogni tubo singolarmente pipettando energicamente. Aggiungere 37,58 microlitri di master mix di trasfezione al controllo del colore, al controllo del colore singolo e a tutti i tubi di controllo del colore e mescolare mediante pipettaggio vigoroso.
Quindi, aggiungere 18,79 microlitri di master mix di trasfezione a ciascun tubo di mix di poli-trasfezione e mescolare bene ogni tubo con un pipettaggio vigoroso. Erogare le miscele di trasfezione nei pozzetti pipettando 65,97 microlitri di ciascuna miscela di trasfezione per i controlli senza colore, colore singolo e tutti i colori nei pozzetti corrispondenti, quindi trasferire 32,98 microlitri del mix di politrasfezione uno nel pozzetto di politrasfezione e distribuire efficacemente i complessi ruotando la piastra rapidamente ma delicatamente in un stretto, Figurare lungo una superficie piana, quindi pipettare 32,98 microlitri di poli-trasfezione mescolare due nello stesso pozzo di poli-trasfezione e ruotare la piastra nello stesso modo. Incubare le cellule per due giorni.
Eseguire la citometria a flusso per leggere la fluorescenza dei marcatori di trasfezione e del reporter di uscita per ogni cellula. Una co-trasfezione ben eseguita, distinta dalla poli-trasfezione mostrata nel video, mostra una stretta correlazione tra TagBFP e EYFP, esprimendo plasmidi che sono stati co-consegnati. Al contrario, una co-trasfezione mal eseguita mostra una scarsa correlazione tra i due plasmidi.
La poli-trasfezione ben eseguita ha mostrato una buona copertura dello spazio bidimensionale e una buona compensazione di qualsiasi sanguinamento spettrale tra proteine fluorescenti. I dati di poli-trasfezione con un basso numero di cellule vive erano difficili da suddividere in un numero sufficiente di contenitori con un numero sufficiente di cellule in ciascun contenitore per l'analisi. Una poli-trasfezione con scarsa efficienza di trasfezione ha portato a una scarsa copertura dello spazio bidimensionale per l'analisi.
L'efficace rapporto del DNA sull'espressione in uscita è stato testato posizionando una proteina repressore, L7Ae con mKO2, e una proteina di output, verde neon con TagBFP, in miscele di trasfezione separate. L'espressione verde neon è stata quindi monitorata a diversi livelli di mKO2 e TagBFP. I risultati della co-trasfezione e della poli-trasfezione sono stati confrontati per questo circuito.
I risultati di 11 singole co-trasfezioni che hanno combinato le parti del DNA mostrate in precedenza sono stati raccolti in un singolo set di dati e confrontati con i dati di poli-trasfezione. Il confronto delle curve dose-risposta di L7Ae che reprime il reporter di output ha mostrato che il livello mediano di output per contenitore era molto simile tra i dati di co-trasfezione e poli-trasfezione. È stata dimostrata un'applicazione di successo della poli-trasfezione per ottimizzare un classificatore di tipi di cellule.
Il micro RNA-21 presente nelle cellule HeLa e nelle cellule non-HEK agisce per abbattere l'espressione di BM3R1 perché BM3R1 reprime la produzione dell'uscita del circuito mKO2. Quando il micro RNA 21 è presente in una cellula, l'espressione di mKO2 sarà attivata. La quantità di Gal4-VP16 sintonizza l'espressione di mKO2 a bassi livelli di BM3R1.
Ogni componente del circuito è stato co-consegnato con un marcatore fluorescente diverso. Questa poli-trasfezione quantifica la quantità di ogni componente del circuito ricevuta da ogni cellula. mKO2 è prodotto in MIR21, producendo cellule HeLa ma non in cellule HEK.
L'uscita di mKO2 è stata analizzata dopo aver consegnato questi componenti del circuito in miscele di trasfezione separate con distinti reporter fluorescenti per indicare la quantità di ciascun componente del circuito ricevuto da una particolare cella. Questo sottocampionamento ha previsto che a questo rapporto, il circuito co-trasfettato aveva una specificità del 91%, una sensibilità del 62% e un'accuratezza del 77%, quando si classificava le celle HEK293 rispetto alle celle HeLa. Il punto dolente più comune in questo protocollo è la mancanza di una stretta correlazione all'interno di ogni mix di trasfezione.
Quindi ricorda di mescolare vigorosamente i tubi di trasfezione subito dopo aver aggiunto il reagente enhancer e poi sii delicatamente mescolando e pipettando i tubi di trasfezione dopo aver aggiunto il mix di trasfezione contenente lipidi I componenti genetici in questa procedura potrebbero essere sostituiti con qualsiasi altro componente genetico per rispondere alle domande sulle loro prestazioni di funzionamento in vari ambienti. Questo metodo ha rapidamente sviluppato circuiti genetici, come classificatori cellulari, controller di feedback e feedforward, motivi bistabili e molti altri.
