Notre protocole facilite et accélère la compréhension des relations entre les parties biologiques. Nous pouvons tester le comportement de nombreuses combinaisons métriques de pièces dans un seul puits. Cette technique permet aux chercheurs de caractériser les relations complexes entre les composants du circuit de manière plus complète avec une plus grande efficacité expérimentale que les approches conventionnelles.
Cette méthode est applicable à la biologie synthétique et à toutes les questions biologiques, sondant les changements de comportement dans une cellule en réponse à différents niveaux de gènes transfectés où la sortie peut être mesurée par cytométrie en flux. Commencez à préparer des tubes pour chaque agrégat d’ADN en mettant de côté les tubes microcentrifugés de 1,5 millilitre étiquetés comme aucun contrôle de couleur, contrôle mKO2, contrôle TagBFP, contrôle vert néon, contrôle toutes les couleurs, mélange de polytransfection un et mélange de poly-transfection deux. Ajouter 36 microlitres de milieu sérique réduit au contrôle sans couleur, au contrôle mKO2, au contrôle TagBFP, au contrôle vert néon et à tous les tubes de contrôle de couleur, puis ajoutez 18 microlitres de milieu sérique réduit à chaque mélange de polytransfection un et mélange de polytransfection deux tubes.
Ensuite, ajoutez 600 nanogrammes de plasmide de remplissage au tube de contrôle sans couleur, 300 nanogrammes de mKO2 et 300 nanogrammes de plasmide de remplissage au tube de contrôle de couleur mKO2 et ajoutez 300 nanogrammes de TagBFP et 300 nanogrammes de plasmide de remplissage au tube de contrôle de couleur TagBFP. Au tube de contrôle de couleur vert néon, ajoutez 300 nanogrammes de vert néon constitutif et 300 nanogrammes de plasmide de remplissage, puis ajoutez 100 nanogrammes de chaque mKO2, TagBFP, vert néon constitutif et 300 nanogrammes de plasmide de remplissage au tube de contrôle toutes les couleurs. Au mélange de polytransfection un tube, ajouter 150 nanogrammes de mKO2, 75 nanogrammes de plasmide vert néon rapporteur et 75 nanogrammes de plasmide de remplissage.
Au mélange de polytransfection à deux tubes, ajouter 150 nanogrammes de TagBFP, 75 nanogrammes de plasmide L7Ae et 75 nanogrammes de plasmide de remplissage. Une fois cela fait, créez le mélange principal de transfection dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre en combinant 216 microlitres de milieu sérique réduit avec 9,48 microlitres de réactif de transfection. Bien mélanger en pipetant de haut en bas avant de le mettre de côté.
Ajoutez 1,58 microlitre de réactif amplificateur à aucun contrôle de couleur, à un contrôle de couleur unique et à tous les tubes de contrôle de couleur et ajoutez 79 microlitres de réactif amplificateur à chaque tube de mélange de polytransfection. Mélanger chaque tube individuellement en pipetant vigoureusement. Ajouter 37,58 microlitres de mélange maître de transfection au contrôle sans couleur, au contrôle monocouleur et à tous les tubes de contrôle de couleur et mélanger en pipetant vigoureusement.
Ensuite, ajoutez 18,79 microlitres de mélange maître de transfection à chaque tube de mélange de poly-transfection et mélangez bien chaque tube avec un pipetage vigoureux. Distribuer les mélanges de transfection dans les puits en pipetant 65,97 microlitres de chaque mélange de transfection pour les contrôles sans couleur, monocolore et toutes couleurs dans les puits correspondants, puis transférer 32,98 microlitres du mélange de poly-transfection dans le puits de poly-transfection et répartir efficacement les complexes en faisant tourbillonner la plaque rapidement mais doucement dans un serré, motif figuré le long d’une surface plane, puis pipeter 32,98 microlitres de la poly-transfection mélanger deux dans le même puits de poly-transfection et agiter la plaque de la même manière. Incuber les cellules pendant deux jours.
Effectuer une cytométrie de flux pour lire la fluorescence des marqueurs de transfection et du rapporteur de sortie pour chaque cellule. Une co-transfection bien réalisée, distincte de la poly-transfection montrée dans la vidéo, montre une corrélation étroite entre TagBFP et EYFP, exprimant les plasmides qui ont été co-délivrés. En revanche, une co-transfection mal réalisée montre une faible corrélation entre les deux plasmides.
Une polytransfection bien réalisée a montré une bonne couverture de l’espace bidimensionnel et une bonne compensation de tout saignement spectral entre les protéines fluorescentes. Les données de polytransfection avec un faible nombre de cellules vivantes étaient difficiles à subdiviser en suffisamment de cellules avec un nombre suffisant de cellules dans chaque cellule pour l’analyse. Une poly-transfection avec une faible efficacité de transfection a entraîné une couverture clairsemée de l’espace bidimensionnel pour l’analyse.
Le rapport efficace de l’ADN sur l’expression de sortie a été testé en plaçant une protéine répressrice, L7Ae avec mKO2, et une protéine de sortie, vert néon avec TagBFP, dans des mélanges de transfection séparés. L’expression du vert néon a ensuite été surveillée à différents niveaux de mKO2 et de TagBFP. Les résultats de la co-transfection et de la poly-transfection ont été comparés pour ce circuit.
Les résultats de 11 co-transfections individuelles qui combinaient les parties d’ADN montrées précédemment ont été rassemblés dans un seul ensemble de données et comparés aux données de polytransfection. La comparaison des courbes dose-réponse de L7Ae réprimant le rapporteur de sortie a montré que le niveau de sortie médian par bac était très similaire entre les données de co-transfection et de poly-transfection. Une application réussie de la polytransfection a été démontrée pour optimiser un classificateur de type cellulaire.
Le micro-ARN-21 présent dans les cellules HeLa et les cellules non-HEK agit pour abattre l’expression de BM3R1 parce que BM3R1 réprime la production de la sortie du circuit mKO2. Lorsque le micro-ARN 21 est présent dans une cellule, l’expression de mKO2 sera activée. La quantité de Gal4-VP16 accorde l’expression de mKO2 à de faibles niveaux de BM3R1.
Chaque composant du circuit a été livré conjointement avec un marqueur fluorescent différent. Cette polytransfection quantifie la quantité de chaque composant du circuit reçue par chaque cellule. mKO2 est produit dans MIR21, produisant des cellules HeLa mais pas dans des cellules TEK.
La sortie mKO2 a été analysée après avoir livré ces composants de circuit dans des mélanges de transfection séparés avec des rapporteurs fluorescents distincts pour indiquer la quantité de chaque composant du circuit reçue par une cellule particulière. Ce sous-échantillonnage a prédit qu’à ce rapport, le circuit co-transfecté avait une spécificité de 91%, une sensibilité de 62% et une précision de 77%, lors de la classification des cellules HEK293 par rapport aux cellules HeLa. Le point douloureux le plus courant dans ce protocole est l’absence d’une corrélation étroite dans chaque mélange de transfection.
N’oubliez donc pas de mélanger vigoureusement les tubes de transfection juste après l’ajout du réactif amplificateur, puis soyez doux avec le mélange et le pipetage des tubes de transfection après l’ajout du mélange de transfection contenant des lipides Les composants génétiques de cette procédure pourraient être remplacés par d’autres composants génétiques pour répondre aux questions sur leur performance fonctionnelle dans divers environnements. Cette méthode a rapidement développé des circuits génétiques, tels que des classificateurs cellulaires, des contrôleurs de rétroaction et de feedforward, des motifs bi-stables et bien d’autres.
