この手順の全体的な目標は、構造研究に十分な大規模なヒト細胞株のミトコンドリアからリボソームを精製することです。このミトコンドリアリボソーム精製法により、複素体、変異体、品質管理アセンブリ、およびミトリボソームサブユニット中間体の翻訳の特性評価が可能になります。これらはミトコンドリアでのタンパク質合成に関する重要な質問に答えるために使用することができます。.
この技術の主な利点は、窒素キャビテーションが細胞の分解に使用され、10〜10の培養細胞のみが高分解構造決定のためにミトリボソームを調製するために必要とされるということです。この技術は、ミトコンドリア翻訳機械の新しい成分の発見をもたらし、さらに癌治療のための新しい治療薬の開発に使用することができます。テキストプロトコルに従ってHEK293S細胞を培養した後、1,000グラムの摂氏4度で遠心分離して細胞の2つの1リットルのチューブを7分間収穫します。
上清を慎重にデカントし、PBSの100ミリリットルで各ペレットを迅速に再懸濁します。その後、細胞をプールし、1、200グラム、摂氏4度で懸濁液を遠心分離します。次に、上清を慎重にデカントした後、ペレットを秤量する。
その後、120ミリリットルのMIBバッファーを使用して再中断し、再懸濁した細胞を冷たい部屋で20分間膨らませます。膨潤した細胞を氷上の冷却済み窒素キャビテーションチャンバーに移します。次いで、細胞に45ミリリットルのSM4バッファーを加える。
窒素キャビテーションチャンバーを留め、圧力が500 PSIに達するまで窒素で満たします。その後、タップを閉じて20分間氷の上に置きます。窒素キャビテーション細胞の溶出法は細胞の外的な物理的ストレスを防ぎ、オルガネラへの熱損傷を避け、窒素ガスは細胞を酸化から守ります。
また、再現性の高い方法です。チャンバー内の圧力をゆっくりと解放し、ライセートを収集します。次いで、細胞の破片および核を除去し、10分間800倍g及び摂氏4度で、その材料を遠心分離する。
表面化物を、折りたたんだマスリン布を通して氷の上に置かれたビーカーに注いで集める。ペレットは廃棄しないでください。ペレットを90ミリリットルのMiBSMバッファーに再懸濁します。
次に、テフロンガラスをホモジナイザーに使用し、試料を均質化し、800倍gと摂氏4度で10分間遠心分離を繰り返します。再び、氷の上に保管されているビーカーにマスリン布の折り畳まれた部分を通してそれを注ぐことによって上清を収集します。次に、この上清を最初の上清と組み合わせます。
サンプルを1,000倍g、摂氏4度で15分間遠心します。その後、上清を以前と同様に集める。ペレットを捨て、粗ミトコンドリアを含む上清を10,000g、摂氏4度で15分間遠心分離する。
しっかりした部分を邪魔することなく、緩いペレットを慎重に洗い流します。その後、10ミリリットルのMiBSMバッファーを使用して、タイトペレットを再懸濁します。サンプルにRNase-Free DNaseを200単位加えてゲノムDNAを除去し、冷たい部屋のローラーでチューブを20分間回転させてサンプルを均等に消化します。
サンプルを10,000回gと摂氏4度で15分間遠心し、2ミリリットルのSEMバッファーを使用してペレットを再懸濁します。ショ糖勾配の上にミトコンドリア懸濁液全体をロードします。テキストプロトコルに従って勾配を紡ぎ、移管ピペットを用いて、32%および60%スクロースの界面で慎重に遊び出る茶色のバンドを収集する。
このプロトコルは、細胞を破壊するために窒素キャビテーションを使用しています。マスターされると、非常に純粋で無傷のミトコンドリアの大規模な分離は9時間以内に行われ、簡単に変更し、異なる細胞の種類とスケールに適応することができます。氷上で凍結したミトコンドリアを解凍した後、ミトコンドリアの3ミリリットルに2量のリシスバッファーを加えます。
チューブを数回反転してすぐに混ぜます。小さなテフロンガラスをホモジナイザーで使用して、リシスを補助し、ホモゲン酸を氷上で5〜10分間インキュベートして反応を完了させます。溶解液を30,000倍gと摂氏4度で20分間遠心分離し、不溶性物質を除去する。
その後、上清を慎重に回収し、ペレットを捨てます。上清の明確化を確実にするために遠心分離を繰り返す。その後、上清を慎重に回収し、ペレットを捨てます。
lysed材料のミリリットルごとに、チューブに0.4ミリリットルのスクロースクッションを加えて、TLA-120.2超クリアチューブにスクロースクッションを用意します。各ショ糖クッションに約1ミリリットルのリズミトコンドリアを重ね、2.5対1のリセート対クッション比を生じる。次いで、サンプルを231、550グラム、摂氏4度でTLA-120.2ローターで45分間遠心分離する。
上清を捨て、100マイクロリットルの再懸濁液を使用してチューブをすすいで、残りのスクロースを除去します。ペレットを再懸濁し、合計100マイクロリットルの再懸濁液バッファーに組み合わせます。クッションペレットを再懸濁しながら、サンプルの加熱を避けるために氷上で行うことと、ミトコンドリアリボソームの構造的完全性を確保するためにサンプルの発泡を避けるためにも不可欠です。
残りの凝集体を溶解し、チューブを17、949回g、摂氏4度で10分間遠心分離するために30秒間遅い速度でサンプルを渦巻く。上清を慎重に回収し、遠心分離を繰り返します。A260でのマイトリボソーム吸収を測定した後、サンプル全体を単一の線形ショ糖勾配チューブに積み込みます。
213、626回g、摂氏4度のTLS-55ローターでサンプルを120分間遠心分離します。勾配を分数するには、チューブの底部を穿刺し、96ウェルプレートに滴下してサンプルを集める。マイトリボソーム精製は、十分な量のミトリボソームに対して7時間以上かかるべきではありません。
この不連続なスクロース勾配で示されるように、精製されたミトコンドリアは32〜60%界面で茶色の下帯に移動する。スクロース勾配上の可溶性ミトコンドリア複合体からのミトリボソームの分離に続いて、2つの主要なミトリボソーム集団が同定され、単数55S及び大型サブユニット39Sである。大きなサブユニット分数の存在は、細胞が積極的に分割状態で収穫されることを示唆しています。
このパネルは、1ピクセル当たり1.23オングストロームのキャリブレーション倍率で、モノサムピーク2からのサンプルを用いた顕微鏡写真を示しています。ここに示されているのは、最初の処理後のデータで、無傷のモノソームを明らかにしています。最後に、このパネルでは、単一の3D再構成を示します。
このビデオを見た後, 構造と生化学的研究のために無傷の人間のミトリボソームを準備する方法をよく理解している必要があります。.当社のプロトコルは、他のミトコンドリア高分子に外挿することができる高品質の最終製剤を提供します。
