心筋梗塞後の成体マウス心臓からのシングルセルRNAシーケンシングのための非心筋細胞懸濁液の調製

私たちのプロトコルは、比較的低コストで単一細胞懸濁液の細胞生存率と単離効率の両方を保証します。実験装置の比較的低いコストと要件は、この技術の主な利点です。シングルセルシーケンシングは、心臓病態生理学における非心筋細胞の不均一性を明らかにし、心臓病の基礎研究と臨床研究のアイデアも提供します。

このプロトコルは、免疫細胞の関与などのMI後の心血管環境に関するこの研究に使用することができます。初めての準備では、サンプルペプシンと消化時間に特別な注意を払うことをお勧めします。原稿に記載されているようにバッファーと溶液が調製されたら、2週間前に心筋梗塞を起こした安楽死マウスを手術台の仰臥位に置きます。

粘着テープを使用して後肢を固定します。心臓を切除するには、体に70%エタノールをスプレーします。肝臓を避けながら、腹部の皮膚と筋肉を垂直に切開します。

心臓に穴を開けずに、胸部を注意深く開き、灌流液が無色になるまで、左心室に予冷PBS溶液をたっぷりと入れます。鉗子を使用して、心臓をそっと持ち上げ、眼科用ハサミでその外側に付着した余分な組織を切り取ります。心臓を1.5ミリリットルの微量遠心チューブ内の1ミリリットルの予冷PBSに入れます。

心臓を氷上に置いた24ウェルプレートのウェルに移します。150マイクロリットルの心臓解離緩衝液をウェルにピペットし、ハサミを用いて心臓を1ミリメートルサイズに切断した。ミンチした心臓組織を、5ミリリットルの組織解離バッファーを含む15ミリリットルの遠沈管に移します。

チューブをサーモスタットレシプロシェーカーに入れます。サスペンションを20分ごとに10回上下にピペットします。塊や未消化組織を除去するには、25ミリリットルの細胞洗浄バッファーを使用して、70マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して細胞懸濁液をろ過します。

遠沈管とセルストレーナーをすすぎます。次に、細胞懸濁液を40マイクロメートルのセルストレーナーでろ過し、さらに細胞凝集塊を取り除きます。ろ過した細胞懸濁液を300 x gで摂氏4度で5分間遠心分離します。

細胞サンプルを5倍量のRBC溶解バッファーに再懸濁し、室温で5分間インキュベートします。次に、前に示したように、細胞懸濁液と遠心分離機に4容量の細胞洗浄バッファーを追加します。上清を捨てた後、細胞を10ミリリットルの細胞洗浄バッファーに再懸濁し、もう一度遠心分離する。

遠心分離の最後に、上清を捨て、ペレットを1ミリリットルの細胞洗浄バッファーに再懸濁します。18マイクロリットルの懸濁液を別の遠沈管に入れ、2マイクロリットルのアクリジンオレンジヨウ化プロピジウム染色溶液を加えます。この染色溶液10マイクロリットルを計数チャンバースライドに加える。

自動セルカウンターを使用して細胞数と生存率を評価します。単一細胞心臓懸濁液中に細胞断片が観察された。蛍光活性化セルソーティングは、細胞断片と細胞凝集の割合を効果的に減少させ、平均細胞サイズを減少させました。

RNAシーケンシングは、教師なしクラスタリングとT分布の確率的隣接埋め込みの減少によって実証されるように、7種類の免疫細胞の明らかな分離を証明しました。各免疫細胞は、古典的なマーカーの高い発現を示した。心臓組織は、不完全な消化を避けるために十分に小さく切断する必要があり、細胞懸濁液に多くの細胞塊が発生します。

このプロトコルによって得られた単一細胞懸濁液は、初代細胞培養のフロー解析にさらに適用することができる。このプロトコルは、心筋感染の微小環境に関する研究に利益をもたらし、研究者が心臓組織を超えて心筋感染を体系的な問題と見なすのに役立つ可能性があります。