Yuvarlak spermatid enjeksiyonu, bazı nonobstrüktif azospermi hastalarında üreme sorununu çözebilir, ancak etkinliği çok düşüktür. Çalışmamızda, farelerde ROSI'nin embriyonik gelişim verimliliğini artırmaya yönelik yöntemler aramak için fareler model olarak kullanılmıştır. Eksik istatistik, dünya çapında 200'den az insan ROSI tarafından tasarlanan fetüsün teslim edildiğini göstermektedir.
ROSI teknolojisinin potansiyelini anlamada bir dönüm noktası, 2015 yılında Tanaka ve meslektaşlarının ROSI teknolojisi aracılığıyla 14 fetüsün başarılı doğumlarını rapor etmesiyle meydana geldi ve klinik uygulaması ve fizibilitesi konusunda yenilenmiş bir güven uyandırdı. ROSI araştırmasının şu anki odak noktası, epigenetik modifikasyonlardaki anormallikler ve anormal oosit destekli aktivasyon üzerineyken, yuvarlak sperm verilerinin doğru bir şekilde tanımlanması da bir zorluktur. Farelerde ROSI embriyolarının gelişim etkinliği diğer laboratuvarlarda olduğu gibi laboratuvarımızda da çok yüksektir.
Bununla birlikte, insanlar gibi kemirgen olmayanların gelişme verimliliği hala çok yenidir. Gelecekte, kemirgen olmayanların gelişim verimliliğinin iyileştirilmesine odaklanacağız. Başlamak için, altı ila sekiz haftalık bir dişi fareye, her biri 7.5 uluslararası birim hamile kısrak serumu gonadotropin ile saat 17: 00'de ve insan koryonik gonadotropini 48 saat sonra intraperitoneal olarak enjekte edin.
Enjeksiyondan sonra erkek farelerle temas olmadığından emin olun. Fareyi ötenazi yaptıktan sonra karın boşluğunu açın. Makas kullanarak, fallop tüplerini her iki yumurtalığın yakınından kesin ve 2 santigrat derecede önceden ısıtılmış M37 tamponuna yerleştirin.
Dik bir mikroskobun 10X hedefi altında, fallop tüpünün şeffaf, büyütülmüş kısmını bulun. Daha sonra, bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, fallop tüpünü sabitleyin, genişlemiş kısmı kesin ve oosit koronal kümülüs komplekslerini toplayın. Granüloza hücrelerini çıkarmak için, oosit kompleksini %0.1 hyaluronidaz içeren önceden ısıtılmış bir M2 çalışma solüsyonuna yerleştirin ve oral bir pipetten hafifçe üfleyin.
Oositi üç kez durulamak için seri olarak KSOMaa damlacıklarına aktarın ve% 5 karbondioksit içeren 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. Başlamak için, ötenazi yapılmış sekiz ila 10 haftalık bir erkek C57BL / 6 fare edinin. Karın boşluğunu açın ve testisin yakınındaki epididimi makasla nazikçe çıkarın.
Epididim içeren kabı M2 ortamında, dik bir mikroskobun 10X objektifi altına yerleştirin. Ve bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, spermatozoanın dışarı akmasına izin vermek için epididimiyi nazikçe çıkarın. Akan spermatozoayı süspansiyon halinde 0.5 mililitre M2 tamponu içeren bir tüpün dibine sifonlayın.
Yuvarlak spermatid izolasyonu için, diseke testisi M2 tamponuna aktarın. Bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, beyaz zarı mikroskop altında nazikçe kesin ve ardından kıvrımlı seminifer tübülleri sıkın ve çıkarın. Süspansiyonu çıkardıktan sonra, 400 gözenekli bir elek ile süzün ve filtrelenmiş hücreleri santrifüjleyin.
Süpernatanı atın ve hücreleri 200 mikrolitre Hoechst 33342 ile 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Lekeli hücreler içeren sitometri tüpünü akış sitometresine yerleştirin. Voltajı ayarladıktan sonra, ileri ve yan saçılmaya göre hücre popülasyonunu seçin.
Ardından, ileri saçılma ve tetik darbe genişliğine göre hücre yapışıklıklarını çıkarın. 355 nanometre dalga boylu lazer altında iki algılama kanalı kullanarak, yuvarlak spermatidleri sıralayın ve dört santigrat derecede saklayın. Mikroskop altında, fare yuvarlak spermatidleri yaklaşık 10 mikrometre çapındaydı ve ortada çıkıntı benzeri bir nükleolus yapısı sergiliyordu.
Başlamak için, farelerden oositler ve yuvarlak spermatidler elde edin. Daha sonra uygun çaplarda tutma ve enjeksiyon iğnelerini hazırlayın. Gametleri yumuşatmak ve saklamak için oositleri sitokalasin B ile veya sitokalasin B olmadan 10 mikrolitre M2 damlacıklarına yerleştirin.
Ardından, yuvarlak spermatidlerin M2 damlacıklarını yerleştirin ve ameliyat çanağını mikroskobik ameliyat masasına monte edin. Enjeksiyonun konumunu ayarlayın ve iğneyi sabitleyin. Polivinilpirolidon veya PVP kullanarak enjeksiyon iğnesini nemlendirin ve temizleyin.
Ardından, yuvarlak spermatidi enjeksiyon iğnesine çıkarın. Oositlerin polar gövdesini saat 12 konumuna yönlendirmek için oositi tutma iğnesi ile döndürün. Ardından, enjeksiyon iğnesini oosit üzerindeki saat üç konumuna dikkatlice yerleştirin.
Bir PiezoXpert cihazı kullanarak, oositlerin zona pellucida'sında bir delik oluşturun. Ardından, enjeksiyon iğnesini yavaşça oositin içine yatay olarak ilerletin ve oosit zarını yırtın. Yuvarlak spermatidi yavaş yavaş oosit sitoplazmasına enjekte edin.
Enjeksiyon iğnesini geri çekin ve kapatmak için açıklığın yakınında küçük bir miktar oosit zarını aspire edin. İntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu için, spermatozoayı bir PVP pistine yerleştirin. Spermatozoayı kuyruktan aspire edin ve boynunu enjeksiyon iğnesinin ağzına yerleştirin.
Sperm kafasını kuyruktan ayırmak için bir piezo uygulayın. Daha sonra, spermi daha önce gösterildiği gibi, dokuz ila 10 mikrometre çapında bir enjeksiyon iğnesi ile oosit içine enjekte edin. Yardımcı oosit aktivasyonu için, oositleri stronsiyum klorür heksahidrat içeren 20 mikrolitrelik kalsiyum ve magnezyum içermeyen CZB ortamına yerleştirin.
Ardından, yetiştirme için KSOMaa kültür ortamına aktarın. Eşzamanlı olarak, embriyolojik çalışmalar için yuvarlak spermatidler veya spermatozoa enjekte etmeden partenogenez aktivasyonu için bir grup oluşturun. Aktivasyondan sonra, yetiştirme için KSOMaa kültür ortamına aktarın.
Yuvarlak spermatid enjekte edilen embriyolar, intrasitoplazmik sperm enjekte edilenlere kıyasla düşük gelişimsel etkinlik göstermiştir.
