神経解剖学的解析のためのマーモセット脳全体の連続2光子断層撮影法

私たちの研究は、ヒトを含む脳機能の構造的基盤を探求するものです。コモンマーモセットをモデルとして、種間で共有される神経接続と霊長類属から固有の神経接続を特定することにより、霊長類の脳をよりよく理解することを目指しています。マーモセット脳の前頭前野突起の包括的なマッピングを行いました。

逐次2光子トモグラフィー法を用いて、脳全体の高精度な3次元再構成に成功し、関連領域間の強固な円柱突起を明らかにしました。シリアル2光子トモグラフィーは、脳全体のスケールで神経接続性を理解するためのデータセットを提供します。私たちのプロトコルは、マーモセットの脳の処理を改善するだけでなく、他の標本の取り扱いに関する洞察も提供します。

まず、分離された固定されたマーモセット脳を取り出し、コラゲナーゼと摂氏37度で1時間インキュベートします。綿棒を使用して、脳の表面を注意深くこすり、ピアマーターやその他の髄膜を剥がします。細い鉗子を使用して、残っている剥離した髄膜を取り除きます。

水素化ホウ素ナトリウム緩衝液を調製するには、0.2グラムの水素化ホウ素ナトリウムを100ミリリットルの50ミリモルのホウ酸緩衝液に溶解し、摂氏40度に予熱します。2.25グラムのアガロースと0.21グラムの過ヨウ素酸ナトリウムを100ミリリットルのリン酸緩衝液中で2〜3時間攪拌することにより、酸化アガロースを調製します。真空吸引を使用して溶液をろ過し、リン酸緩衝液を3回交換して洗浄します。

次に、アガロースを50ミリリットルのリン酸緩衝液に再懸濁します。次に、アガロースを電子レンジで完全に溶かし、摂氏60〜65度に冷まします。脳をカスタムメイドのチャンバーに入れ、脳をアガロースに埋め込むことで、アガロースが脳梁の下の空洞を満たすようにします。

アガロースゲルを固化した後、チャンバーを分解し、アガロースブロックを水素化ホウ素ナトリウム緩衝液に摂氏4度で一晩浸します。次に、エポキシインスタントミックスを使用して、ネオジム磁石を4つ取り付けてスライドガラスステージを構築します。アガロースブロックを強力な接着剤を使用してステージに取り付けます。

ティッシュイメージングシステム全体を製造元の指示に従って操作します。マーモセットの脳全体を前端から後端まで冠状に処理します。次に、ブレードの角度を調整して、両端の表面の深さが10マイクロメートル以内になるようにします。

これを行うには、ピエゾコントローラーを使用して対物レンズの位置を変更して上面を検索します。結像面を表面から約25〜35マイクロメートルに設定して、密集した髄鞘形成を補正し、均一なレーザー透過を確保します。セラミックの刃を使って、脳全体を50マイクロメートル間隔に切り、約650スライスを作ります。