Tomografia seriada de dois fótons de todo o cérebro do sagui para análises neuroanatômicas

Nossa pesquisa explora a base estrutural das funções cerebrais, incluindo as dos humanos. Usando o sagui comum como modelo, pretendemos entender melhor o cérebro dos primatas, identificando conexões neurais que são compartilhadas entre as espécies e aquelas que estão exclusivamente fora do gênero dos primatas. Realizamos um mapeamento abrangente das projeções pré-frontais do cérebro do sagui.

Usando a técnica de tomografia serial de dois fótons, conseguimos uma reconstrução 3D altamente precisa de todo o cérebro, que revelou projeções colunares robustas entre as áreas de associação. A tomografia serial de dois fótons fornece um conjunto de dados para entender a conectividade neural em toda a escala do cérebro. Nosso protocolo não apenas ajuda a melhorar o processamento de cérebros de saguis, mas também oferece informações sobre o manuseio de outras amostras.

Para começar, pegue o cérebro isolado e fixo do sagui e incuba-o com colagenase a 37 graus Celsius por uma hora. Usando um cotonete, esfregue cuidadosamente a superfície do cérebro para retirar a pia-máter e outras meninges. Use uma pinça fina para remover quaisquer meninges destacadas restantes.

Para preparar o tampão de borohidreto de sódio, dissolva 0,2 gramas de borohidreto de sódio em 100 mililitros de tampão borato de 50 milimoles, pré-aquecido a 40 graus Celsius. Prepare a agarose oxidada mexendo 2,25 gramas de agarose e 0,21 gramas de periodato de sódio em 100 mililitros de tampão fosfato por duas a três horas. Filtrar a solução por sucção a vácuo e lavá-la com três trocas de tampão fosfato.

Em seguida, ressuspenda a agarose em 50 mililitros de tampão fosfato. Em seguida, derreta completamente a agarose em um forno de micro-ondas e deixe esfriar de 60 a 65 graus Celsius. Coloque o cérebro em uma câmara feita sob medida e incorpore o cérebro em agarose, garantindo que a agarose preencha a cavidade abaixo do corpo caloso.

Após a solidificação do gel de agarose, desmontar a câmara e mergulhar o bloco de agarose no tampão borohidreto de sódio durante a noite a quatro graus Celsius. Agora, usando uma mistura instantânea de epóxi, construa um palco de vidro deslizante anexando quatro ímãs de neodímio. Monte o bloco de agarose no palco usando um adesivo forte.

Opere todo o sistema de imagem de tecido seguindo as instruções do fabricante. Processe todo o cérebro do sagui coronalmente das extremidades anterior para posterior. Em seguida, ajuste os ângulos da lâmina para garantir que as profundidades da superfície em ambas as extremidades estejam dentro de 10 micrômetros.

Para fazer isso, procure a superfície superior alterando a posição da objetiva, usando o controlador piezoelétrico. Defina o plano de imagem para aproximadamente 25 a 35 micrômetros da superfície para compensar a mielinização densa e garantir a penetração uniforme do laser. Usando uma lâmina de cerâmica, corte todo o cérebro em intervalos de 50 micrômetros, resultando em aproximadamente 650 fatias.