Serielle Zwei-Photonen-Tomographie des gesamten Weißbüschelaffen-Gehirns für neuroanatomische Analysen

Unsere Forschung erforscht die strukturellen Grundlagen von Gehirnfunktionen, auch beim Menschen. Am Modell des Weißbüschelaffen wollen wir das Gehirn von Primaten besser verstehen, indem wir neuronale Verbindungen identifizieren, die von allen Arten gemeinsam genutzt werden, und solche, die eindeutig aus der Gattung der Primaten stammen. Wir führten eine umfassende Kartierung der präfrontalen Projektionen des Weißbüschelaffengehirns durch.

Mit Hilfe der seriellen Zwei-Photonen-Tomographie gelang uns eine hochgenaue 3D-Rekonstruktion des gesamten Gehirns, die robuste säulenförmige Projektionen zwischen den Assoziationsbereichen zeigte. Die serielle Zwei-Photonen-Tomographie liefert einen Datensatz zum Verständnis der neuronalen Konnektivität auf der gesamten Gehirnskala. Unser Protokoll hilft nicht nur, die Verarbeitung von Weißbüschelaffengehirnen zu verbessern, sondern bietet auch Einblicke in den Umgang mit anderen Proben.

Zu Beginn nehmen Sie das isolierte, fixierte Weißbüschelaffengehirn und inkubieren es eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius mit Kollagenase. Reiben Sie mit einem Wattestäbchen vorsichtig über die Gehirnoberfläche, um die Pia mater und andere Hirnhäute abzuziehen. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette die verbleibenden abgelösten Hirnhäute.

Zur Herstellung des Natriumborhydridpuffers werden 0,2 Gramm Natriumborhydrid in 100 Millilitern 50 Millimol Boratpuffer gelöst, der auf 40 Grad Celsius vorgewärmt wird. Bereiten Sie oxidierte Agarose vor, indem Sie 2,25 Gramm Agarose und 0,21 Gramm Natriumperiodat zwei bis drei Stunden lang in 100 Milliliter Phosphatpuffer rühren. Filtrieren Sie die Lösung mit einem Vakuumsauger und waschen Sie sie mit drei Wechseln des Phosphatpuffers.

Dann resuspendieren Sie die Agarose in 50 Millilitern Phosphatpuffer. Anschließend die Agarose in der Mikrowelle vollständig schmelzen und auf 60 bis 65 Grad Celsius abkühlen lassen. Platzieren Sie das Gehirn in einer speziell angefertigten Kammer und betten Sie das Gehirn in Agarose ein, um sicherzustellen, dass die Agarose den Hohlraum unter dem Corpus Callosum ausfüllt.

Nach dem Erstarren des Agarosegels zerlegen Sie die Kammer und tauchen den Agaroseblock über Nacht bei vier Grad Celsius in den Natriumborhydridpuffer. Bauen Sie nun mit einem Epoxid-Instant-Mix einen Dia-Glastisch, indem Sie vier Neodym-Magnete anbringen. Befestigen Sie den Agaroseblock mit einem starken Kleber auf dem Tisch.

Betreiben Sie das gesamte Gewebebildgebungssystem gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verarbeiten Sie das gesamte Weißbüschelaffen-Gehirn koronal von den vorderen zu den hinteren Enden. Passen Sie dann die Klingenwinkel an, um sicherzustellen, dass die Oberflächentiefen an beiden Enden innerhalb von 10 Mikrometern liegen.

Suchen Sie dazu nach der oberen Oberfläche, indem Sie die Position des Objektivs mit dem Piezo-Controller ändern. Stellen Sie die Bildgebungsebene auf etwa 25 bis 35 Mikrometer von der Oberfläche ein, um die dichte Myelinisierung zu kompensieren und eine gleichmäßige Laserpenetration zu gewährleisten. Schneiden Sie mit einer Keramikklinge das gesamte Gehirn in 50-Mikrometer-Intervalle, so dass Sie etwa 650 Scheiben erhalten.