Серийная двухфотонная томография всего мозга мартышки для нейроанатомического анализа

Наше исследование посвящено структурным основам функций мозга, в том числе и у человека. Используя обыкновенную игрунку в качестве модели, мы стремимся лучше понять мозг приматов, выявив нейронные связи, которые являются общими для всех видов, и те, которые однозначно принадлежат к роду приматов. Мы провели комплексное картирование префронтальных проекций мозга мартышки.

С помощью метода серийной двухфотонной томографии нам удалось с высокой точностью провести 3D-реконструкцию всего мозга, которая выявила устойчивые столбчатые проекции среди ассоциативных областей. Последовательная двухфотонная томография предоставляет набор данных для понимания нейронных связей на всем уровне мозга. Наш протокол не только помогает улучшить обработку мозга игрунок, но и дает представление об обращении с другими экземплярами.

Для начала возьмите изолированный, неподвижный мозг мартышки и инкубируйте его коллагеназой при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. С помощью ватного тампона тщательно разотрите поверхность мозга, чтобы отклеить матерь и другие мозговые оболочки. С помощью тонких щипцов удалите оставшиеся отслоившиеся мозговые оболочки.

Для приготовления буфера из борогидрида натрия растворите 0,2 грамма боргидрида натрия в 100 миллилитрах 50 миллимолей боратного буфера, предварительно подогретого до 40 градусов Цельсия. Приготовьте окисленную агарозу, размешав 2,25 грамма агарозы и 0,21 грамма периодата натрия в 100 миллилитрах фосфатного буфера в течение двух-трех часов. Отфильтруйте раствор с помощью вакуумного отсоса и промойте его тремя заменами фосфатного буфера.

Затем повторно суспендируйте агарозу в 50 миллилитрах фосфатного буфера. Далее полностью растопите агарозу в микроволновой печи и дайте ей остыть до 60-65 градусов по Цельсию. Поместите мозг в специально изготовленную камеру и вживите мозг в агарозу, убедившись, что агароза заполнит полость под мозолистым телом.

После застывания агарозного геля разберите камеру и погрузите агарозный блок в буфер из борогидрида натрия на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. Теперь, используя эпоксидную растворимую смесь, постройте предметное стекло, присоединив четыре неодимовых магнита. Закрепите агарозный блок на сцене с помощью прочного клея.

Работайте со всей системой визуализации тканей в соответствии с инструкциями производителя. Обработайте весь мозг игрунки коронально от переднего к заднему концам. Затем отрегулируйте углы наклона лезвий, чтобы глубина поверхности на обоих концах была в пределах 10 микрометров.

Для этого нужно искать верхнюю поверхность, изменяя положение объектива, с помощью пьезоконтроллера. Установите плоскость визуализации примерно на расстоянии от 25 до 35 микрометров от поверхности, чтобы компенсировать плотную миелинизацию и обеспечить равномерное проникновение лазера. С помощью керамического лезвия разрежьте весь мозг на интервалы 50 микрометров, получив примерно 650 срезов.