신경 해부학적 분석을 위한 전체 마모셋 뇌의 연속 이광자 단층촬영(Serial Two-Photon Tomography of the whole Marmoset Brain)

우리의 연구는 인간을 포함한 뇌 기능의 구조적 기초를 탐구합니다. 우리는 Common 마모셋을 모델로 사용하여 종 간에 공유되는 신경 연결과 영장류 속에서만 고유한 신경 연결을 식별하여 영장류의 뇌를 더 잘 이해하는 것을 목표로 합니다. 우리는 마모셋 뇌의 전전두엽 돌기에 대한 포괄적인 매핑을 수행했습니다.

연속 이광자 단층촬영(continuous two-photon tomography) 기법을 사용하여 전체 뇌를 매우 정확하게 3D로 재구성하는 데 성공했으며, 이를 통해 연관 영역 간의 강력한 기둥 투영이 드러났습니다. 직렬 이광자 단층촬영은 전체 뇌 규모에서 신경 연결성을 이해하기 위한 데이터 세트를 제공합니다. 당사의 프로토콜은 마모셋 뇌의 처리를 개선하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 다른 표본을 처리하는 방법에 대한 통찰력을 제공합니다.

먼저 분리되고 고정된 마모셋 뇌를 채취하여 섭씨 37도의 콜라겐 분해 효소로 1시간 동안 배양합니다. 면봉을 사용하여 뇌 표면을 조심스럽게 문질러 피아 메이터와 다른 수막을 벗겨냅니다. 가는 집게를 사용하여 남아 있는 분리된 수막을 제거합니다.

수소화붕소나트륨 완충액을 준비하려면 섭씨 40도로 예열된 50밀리몰 붕산염 완충액 100밀리리터에 수소화붕소나트륨 0.2g을 용해시킵니다. 100ml의 인산염 완충액에 2.25g의 아가로스와 0.21g의 오디네이트나트륨을 2-3시간 동안 교반하여 산화된 아가로스를 준비합니다. 진공 흡입을 사용하여 용액을 여과하고 인산염 완충액을 세 번 변경하여 세척합니다.

그런 다음 아가로스를 50ml의 인산염 완충액에 재현탁합니다. 다음으로 아가로스를 전자레인지에 완전히 녹여 섭씨 60도에서 65도까지 식힙니다. 뇌를 맞춤 제작된 방에 넣고 뇌를 아가로스에 삽입하여 아가로스가 말뭉치 아래의 구멍을 채우도록 합니다.

아가로스 겔의 응고 후, 챔버를 분해하고 아가로스 블록을 수소화붕소나트륨 완충액에 섭씨 4도에서 밤새 담그십시오. 이제 에폭시 인스턴트 믹스를 사용하여 4개의 네오디뮴 자석을 부착하여 슬라이드 유리 스테이지를 구성합니다. 강력한 접착제를 사용하여 아가로스 블록을 스테이지에 장착합니다.

제조업체의 지침에 따라 전체 조직 이미징 시스템을 작동하십시오. 마모셋 뇌 전체를 전방에서 후방까지 관상동맥으로 처리합니다. 그런 다음 블레이드 각도를 조정하여 양쪽 끝의 표면 깊이가 10마이크로미터 이내가 되도록 합니다.

이렇게 하려면 피에조 컨트롤러를 사용하여 대물렌즈의 위치를 변경하여 상단 표면을 검색합니다. 이미징 평면을 표면에서 약 25-35마이크로미터로 설정하여 조밀한 수초화를 보정하고 균일한 레이저 침투를 보장합니다. 세라믹 칼날을 사용하여 뇌 전체를 50마이크로미터 간격으로 자르면 약 650개의 조각이 만들어집니다.