의 식민지 Euprymna scolopes 오징어에 의한 장염 fischeri</em

요약

방법에 의한 하와이의 꼬리 자른 오징어 절차를 간략하게 설명 Euprymna scolopes와 세균성 symbiont, 장염 fischeri, 박테리아에 의한 오징어 표시등 기관의 특정 식민지 수 있도록 도입 별도로하고 사육하고 있습니다. bacterially-파생된 발광에 의한 직접적인 식민지의 계산에 의한 식민지 감지 기능이 설명되어 있습니다.

초록

특정 박테리아는 동물 조직을 ^1-5으로 협회에서 발견된다. 이러한 호스트 세균성 협회는 (symbioses) (병원성) 해로운가 될 수없고 피트니스 결과 (공생)가없는, 또는 (mutualistic) 유익합니다. 많은 관심은 병원성 상호 작용 부여되어 있지만, 거의가 환경에서 공생 / 유익한 박테리아의 재현성 인수를 지시하는 프로세스에 대해 알려져 있습니다. 해양 그람 음성 세균 사이의 가벼운 장기 mutualism V. fischeri와 하와이 꼬리 자른 오징어, E. scolopes는 하나의 호스트 (E. scolopes)는 자사의 일생 ^6,7의 과정 전반에 걸쳐 하나의 세균 종 (V. fischeri)와 공생 관계를 수립하는 매우 구체적인 상호 작용을 나타냅니다. V. 제작한 Bioluminescence 이 상호 작용하는 동안 fischeri는 엑스타시의 안티 육식 혜택을 제공합니다 야행성 활동 ^8,9 중 scolopes 반면영양이 풍부한 호스트 조직을 제공 V. 보호 틈새 ^10과 fischeri. 각 호스트 생성하는 동안,이 관계는 따라서 공생 발전의 다양한 단계에서 세부 평가 수있는 예측 가능한 프로세스를 대표 recapitulated있다. 첫 번째 30~60분 내에 수집 symbiont없는 물로 전송하는 경우 실험실에서 청소년 오징어 해치 aposymbiotically (uncolonized), 그리고는, 실험 inoculum ^6에 의한 경우를 제외하고 식민지하실 수 없습니다. 이 상호 작용함으로써 환경 ^11,12의 공생 미생물의 특정 취득으로 이어질 개별 단계를 평가하는하는 유용한 모델 시스템을 제공합니다.

여기 새로 aposymbiotic E.을 꾸몄다고 때 발생하는 식민지의 정도를 평가하는 방법을 설명 scolopes는 (인공)이 포함된 해수에 노출되는 V. fischeri 있습니다.이 간단한 분석은 접종, 자연 감염 및 복구에 대해 설명E.의 초기 조명 장기에서 세균성 symbiont의 scolopes. 케어는 특히 수질과 라이트 단서와 관련하여, 공생 개발하는 동안 동물을위한 일관된 환경을 제공하기 위해 가져옵니다. 설명 공생 인구를 특성화하기위한 방법은 bacterially-파생 bioluminescence (1) 측정 및 회복 symbionts의 계산 (2) 직접 식민지를 포함합니다.

프로토콜

1. 세균성 Inocula의 작성

1. 데이 0
   오징어 접종, 접시 LBS에 관련된 박테리아 변종 ¹³ 한천 이전 이틀.
2. 25-28 ° C에서 하룻밤 사이에 박테리아를 품어.
3. 1 일
   각 V. 중 하나를 식민지로 유리 문화 튜브의 중간 세 ML LBS의 예방 감염 fischeri 변형. 백업으로 튜브를 복제 준비합니다.
4. 날 2
   (오징어 단계 3.7-3.10와 세균 단계 1.4-1.6 조정)
   이전 접종 1 H, subculture 박테리아 유리 문화 튜브 3 ML의 LBS에 1:80 (37.5 μl)와 폭기 : 1 개 H 위해 성장.
5. 접종 이전 시료의 OD _600을 측정합니다. 일반적인 측정은 0.3-0.6 변형에 따라 있습니다.
6. Inoculum 볼륨 (μl) = 1.25 / OD ₆₀ : 3-5 X의 대상 inoculum 내용 10 ³ CFU / ML은 다음과 같이 inoculum 볼륨을 계산0 (예 : OD ₆₀₀ = 0.5, 계산 inoculum 볼륨 = 1.25/0.5 = 2.5 μl).이 금액은 단계 4.1 오징어를 포함하는 바닷물에 직접 추가됩니다. 이 계산 V.의 여러 변종에 따라 조정해야 할 수도 있습니다 fischeri 또는 여기에 지정된 것보다 낮은 또는 높은 수준의 접종입니다.

2. Inocula의 열거를위한 한천 플레이트의 작성

1. 각 치료 단계 4.1 inoculum의 플레이트 샘플에 대한 레이블 LBS 플레이트 (대우 당 2).
2. 판 당 5 멸균 도금 구슬을 추가합니다.

3. 오징어 점이 모음집

1. 굴절계를 사용하여 인스턴트 바다의 염분을 측정하는 35 ‰로 조정합니다.
2. 필터 - 살균 인스턴트 오션 (FSIO)를 생성하는데, 여과 장치와 연결된 진공 라인 또는 진공 펌프를 사용하여 인스턴트 오션 1 패을 필터링합니다. 각 분배에 적극적으로 사전에 소용돌이에 의해 산소를 물. 일전자 필터 유닛은 2 일 동안 활용할 수 있습니다.
3. 두 (2) 일회용 샘플 그릇의 각으로 나누어지는 FSIO의 40-50 ML합니다. 라벨 earlies 같은 하나 timelies 같은 하나.
4. 피펫에게 가장 낮은 산등성이 위에 팁을에서 약 1 센티미터, (그림 3 참조) 절단하여 청소년 오징어 취득을위한 플라스틱 전송 pipettes의 초과를 준비합니다. 이것은 오징어 수령시 합격 할수있는 넓은 공간을 용이하게합니다. 거친 노출된 표면이있는 모든 전송 pipettes 폐기하십시오.
5. 준비된 전송 pipettes 사용하여 E. 수집 하룻밤 사이에 부화하고 FSIO의 earlies 그릇에 전송되는 scolopes. 조기 hatchlings 1 이상 H 위해 계란 시스템에 왔고 오염에 의해 식민지로 감염될 수 있습니다했습니다 V. 계란 시스템의 fischeri. 민감한 식민지 실험을 위해 earlies를 사용하지 마십시오.
6. 계란 탱크에게 새로운 hatchlings 때마다 30-45 분를 확인하십시오. 모든 hatchlings는 각 사용자 동안 해제되는 것을 보장도대체. FSIO의 timelies 그릇으로 전송 피펫, 그리고 예금과 hatchlings를 제거합니다. 적시에 수집 동물 식민지 실험에 사용할 수 있습니다.
7. 수집이 완료되면 (~ 45 분 황혼 이후), 주요 연구실로 오징어를 전송합니다. 경험적으로 그것은 3 시에 예방 접종에 대한 중단 실험실 조명 조건 하에서 동물을 식민지에 유리합니다.
8. 각각의 치료, 40 ML FSIO와 그릇을 준비합니다. (최대 N = 40 그릇 당) 분석을위한 그릇에 오징어를 추가합니다.
9. aposymbiotic (부정적) 제어로 추가 그릇을 준비합니다.
10. 각 치료 전용 전송 피펫을 준비합니다.
11. 2 %의 에탄올에 추가 오징어를 안락사.

4. 오징어 콜로니

1. 주 2 - P10 Pipetman를 사용하여, 각 치료를 위해 각 오징어 덮밥 (3.8 단계)로 박테리아의 계산 나누어지는 (단계 1.5) 분배. 즉시 3 시에 타이머를 시작합니다첫 번째 접종.
2. 각 치료의 경우 그릇의 가장자리 근처에 피펫을 넣어 약 10 초 동안 물 오징어를 섞어 반복하고 아래까지 pipetting하여 전용 전송 피펫과 그릇 "소용돌이"를 만듭니다. 혼합 철저한가 중요합니다.
3. 2.2 단계에서 LBS 한천 플레이트를 향해 각 그릇의 플레이트 50 μl가 (기술에 대한 치료 당 번호판이 50 μl 번호판을 복제합니다.) 25-28 ° C에서 하룻밤 사이에 알을 품다.
4. 각 치료 세차 그릇 (100 ML FSIO / EA)를 준비합니다.
5. 각 오징어에 대한 Drosophila 튜브를 (4 ML ​​FSIO / EA) 준비합니다.
6. 정확히 3 시에 후, 각각의 세차 그릇 (모든 치료 완료)로 오징어를 전송합니다. 이것은 접종 중지됩니다.
7. FSIO와 자체 Drosophila의 유리병에 각각 오징어를 전송 진행합니다. 각 치료 지정 전송 피펫을 사용합니다.
8. 일 / N로 돌아가려면 오징어 시설에 Drosophila 유리병의 쟁반으로 이동항공 라이트 사이클 동물 embryogenesis 동안 경험했다.
9. 3 일 - 각 오징어를 준비 Drosophila 튜브 (4 ML ​​FSIO / EA).
10. 22-24 H 포스트 - 접종시 황혼에 앞서, 새로운 Drosophila의 병을 각 오징어를 전송합니다. 각 치료 지정 전송 피펫을 사용합니다.
11. 일 4 - 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 (1/squid)를 분류 준비합니다.
12. 이전 46-48 H 포스트 접종, 측정의 황혼과 Drosophila의 유리병 (6의 통합 및 뚜껑 폐쇄에 자동으로 읽기위한 luminometer 세트)의 각 오징어의 발광을 기록합니다.
13. 배경 발광에 대한 부정적인 통제 마찬가지로 모든 오징어를 포함하지 않는 FSIO있는 유리병을 측정합니다.
14. 단계 4.12에서 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 대략 700 μl의 볼륨의 각 오징어를 전송합니다. 판지 냉동실 상자로 이동합니다. 뚜껑이있는 상자에 배치되면, 아, 아닌 박테리아의 퇴학에 대한 가벼운 단서로 제거하지 마십시오L-이해.
15. -80 ° C에서 하룻밤 사이에 microcentrifuge 튜브를 고정.

5. 콜로니 레벨의 결정

1. 각 오징어 들어, 475 μl FSIO (또는 70% 인스턴트 오션을 autoclaved)로 두 (2) microcentrifuge 튜브, 각각 준비합니다.
2. 먼저 유봉을 청소하고 총 부스러기 및 / 또는 조직을 제거하는 Kimwipe를 사용하여 pestles을 준비합니다.
3. 장소는 95 % 에탄올을 포함하는 50 ML의 비커에 팁 다운 pestles. 에탄올은 약 3cm의 높이에 추가되어 있어야합니다.
4. 각 유봉 들어, 비커에서 제거하고 Kimwipe와 팁을 닦아냅니다.
5. 에탄올 욕조로 다시 유봉 수영 제거하고 삽입 (최대 팁) microcentrifuge 튜브 랙에 약 15 분 동안 완전히 건조한을 발표하실 수 있습니다.
6. microcentrifuge 튜브 랙에 해동의 오징어 (최대 N = 8).
7. 필요한 경우, 700 μl로 볼륨을 조정합니다.
8. 단계 5.5에서 유봉을 사용하여 잉크 SAC RUP 때까지 동물의 조직을 혼란tures (물이 어두운 회색 색상을 설정합니다.)
9. 유봉을 제거하고 모든 조직은 튜브에 남아 보장합니다.
10. 정확히 10 초 (타이머를 사용)의 소용돌이 조직 간단히합니다.
11. 조직이 10 분 동안 휴식을 허용합니다. 조직이 정착되고 박테리아와 잉크 용액에 남아 있습니다. 따라 계산은 박테리아 / 잉크 솔루션은 [] 희석 (즉, 700 μl의 E. scolopes 조명 장기 homogenate)입니다. 시리얼 1시 20분의 dilutions ([B] [C]) 아래에 설명되어 있습니다.
12. [B] 희석 들어, 단계 5.1에서 준비 microcentrifuge 튜브 중 25 μl []를 추가합니다. 와동.
13. [C] 희석의 경우, 25 μl를 추가 [B] 단계 5.1에서 준비 microcentrifuge 튜브 중 하나. 와동.
14. LBS 한천 배지를 향해 각 희석의 플레이트 50 μl, 2는 치료에 따라 복제합니다.
15. 25-28 ° C에서 하룻밤 사이에 번호판을 품어.

6. 데이터 분석

1. CFU / 조명 기관 (LO), coun을 계산하려면각 치료 접시 t 식민지가되는 10-400 식민지가 존재하고, 적절한 수식을 사용 :
   CFU / LO = ([] 접시 식민지) × 14, 또는
   CFU / LO = ([B] 접시 식민지) × 280, 또는
   CFU / LO = ([C] 접시 식민지) × 5,600.
2. 대수 규모의 개별 데이터 포인트와 medians 잡아.
3. 데이터는 종종 일반적으로 다른 차이와 함께 배포되지 않은, 그리고 outliers는 의미 생물 학적 정보를 포함할 수 있습니다. 따라서 비 파라메 트릭 테스트는 치료가 크게 차이가 있는지 여부를 결정하는 유용한 방법을 제공합니다.
4. 통계 분석을 위해 GraphPad 프리즘 소프트웨어를 사용합니다. 이 치료법은 윌콕슨이 순위 합 테스트를 사용합니다. 보다보다 두 요법 간의 비교 들어, 적절한 사후 검사와 Kruskal-월리스 테스트를 사용합니다.

7. 대표 결과

샘플 식민지 분석의 결과는 그림 4에 표시됩니다. 두 변종 V. 발광 여러 상대적인 수준을 전시 fischeri는 aposymbiotic (uncolonized) 컨트롤을 역임 여섯 오징어와 함께, 여섯 오징어로 주사 각각 있었다. E. scolopes symbiont, ES114 ^14, 그리고 밝은 Sepiola robusta symbiont, SR5 ^15,16. 비슷한 inoculum 수준 (그림 4A)는 3 시에 이내에 100 %의 식민지로 이어집니다. 48 H에서 발광 수준 (그림 4B)와 CFU 카운트는 (그림 4C) 변형의 식민지 능력을 평가하기 위해 결정됩니다. 특정 발광 (그림 4D, 당 세균)의 결정이 공생하는 동안 각 세균 변형의 밝기의 결정을 허용합니다.

식민지 절차의 그림 1. 플로우 차트. 박테리아와 오징어가 지정한 inoculum에서 혼합 후, 별도로 수확한다. 오징어는 씻어되고 나서 3 시에, 24 H, 4에서 새로운 물로 전송 8 H 포스트 접종. 48 H에서 발광 측정되고 동물 얼었어,이 동물을 표면 소독을 제공합니다. 라이트 - 장기 박테리아가 -80에서 가능한 남아있는 식민지 ° C을 한쪽 해동 (별도의 냉동 해동 사이클)를 통해.

균질화 및 박테리아의 희석 도금을 보여주는 그림 2. 플로우 차트. 직렬 20 배 dilutions 식민지가 박테리아의 열거에 적절한 다이나믹 레인지를 제공합니다.

그림 3. 청소년 오징어를 손상시킬 수있는 좁은 구멍 ()에 적절하게 좁은 샤프트 테이퍼와 pipettes을 전송합니다. 가위 또는 면도날과 좁은 부분을 없애 버리려하고 전처리가 (B) 청소년 오징어를 전송하는 적절한 도구를 얻을.

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그림 4. 식민지 분석을위한 샘플 데이터입니다. inoculum 그릇에있는 박테리아의 (A) 수준. 개별 오징어의 (B) 발광. (C) 각 오징어의 식민지 카운트. 개별 오징어의 (D) 특정 발광. APO, Aposymbiotic (부정적인 제어를 uncolonized).

토론

설명 식민지 분석은 통제된 실험실 환경에서 자연 공생 프로세스의 분석을 위해 수 있습니다. 따라서, 그것은 서로 다른 자연의 분리에 의한 돌연변이 종자에 의해 서로 다른 화학 정권 아래에서 식민지를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 설명된 실험에서 유사 일반적 공생의 다양한 측면을 평가하는 데 사용됩니다. 식민지의 속도론은 우연 탐지기가 제거된있는 신틸레이션 계수기에서 자동으?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
유리 문화 튜브, 16 밀리미터 직경	VWR	47729-580
유리 문화 튜브를위한 모자	어부	NC9807998
OD 600 결정에 대한 표시 분광	Biowave	CO8000	OD 600을 측정할 수있는 분광 광도계가 작동합니다. 이 기기는 유리 배양 튜브에 직접 액체가 OD 600을 측정할 수 있습니다. inoculum 계산의 일부 조정이 사용되는 장비에 따라 필요할 수 있습니다.
GloMax 20분의 20 단일 튜브 Luminometer	Promega	E5311	터너 BioSystems 20/20n Luminometer에 상응. microcentrifuge 튜브 홀더가 포함되어 있습니다.
GloMax 20분의 20 라이트 스탠다드	Promega	E5341	luminometer 교정하십시오.
굴절계, 핸드헬드	포스터와 스미스 수상	CD-14035	탈이온수 각각 사용하기 전에 보정. 소금을 빌드 - 업 방지하기 위해 탈이온수있는 모든 사용 후 린스.
인스턴트 오션 (인공 해수 농축)	포스터 & 스미스 수상	CD-16881	0.2 μm의 SFCA 필터를 통해 다음 필터, 굴절계를 이용하여 탈이온수 35 ‰에서 준비합니다.
여과 장치	Nalgene	158-0020	계면 활성제가없는 셀룰로스 아세테이트 (SFCA) 멤브레인 0.2 μm의. 우리는 몇 가지 계면 활성제 함유 PES 필터와 가변 결과를 관찰했습니다.
전송 Pipettes	어부	13-711 -오전 9시	가위 또는 면도날을 사용하여 깔끔하게 피펫 팁의 직경을 증가시키고 오징어 hatchlings 손을 쓰고 피하기 위해 첫 번째 능선 위의 팁을 했네요.
일회용 샘플 그릇 (플라스틱 tumblers)	혜성	T9S (9온스)	상부 직경 3 접종을위한 그릇, ¼ "더 낮은 직경이 ¼", 높이 3 ". 그들이 오징어는 낮은 산소의 틈새에 갇혀받을 수있는 더 아래쪽 가장자리를, 없다로 갔었는 동질적인 환경을 만듭니다. 크기가 최적화됩니다 40-ML inoculum. webstaurantstore.com에서 가능 # 619PI9.
Drosophila 튜브	VWR	89092-720	유리병 직경은 luminometer의 PMT에 오프닝과 일치합니다.
1.5 ML의 Microcentrifuge 튜브	ISC Bioexpress	C-3217-1CS	튜브 pestles의 모양에 맞게해야합니다.
에탄올, 200 입증	어부	BP2818-100
Pestles	킴블의 체이스 / Kontes	749521-1500
도금 비즈, 5 밀리미터 직경	킴블의 체이스	13,500 오	튜브 및 압력솥 당 5 준비합니다.