가벼운 외상성 뇌 손상 후 Hippocampal 회로 기능의 수선에 관한 조사

요약

hippocampal 회로에 대한 기능 변경 사항을 조사에 대한 다원적 인 측면의 접근이 설명되어 있습니다. Electrophysiological 기술은 부상 프로토콜, 행동 테스트 및 지역 해부 방법과 함께 설명되어 있습니다. 이러한 기술의 결합은 다른 뇌 영역과 과학 질문에 대해서도 이와 유사한 방식으로 적용 할 수 있습니다.

초록

외상성 뇌 손상은 (외상성 뇌 손상) 매년 미국에서 이상 1백70만명을 괴롭히는, 심지어 가벼운 외상성 뇌 손상은 영구적 신경 장애 ¹ 될 수 있습니다. 외상성 뇌 손상 생존자, 메모리 결손 및 발작 임계 값의 감소에 의해 경험 두 보급 및 비활성화 증상은 외상성 뇌 손상 유발 hippocampal 장애 ^2,3에 의해 중재 할 생각입니다. hippocampal 회로 기능이 나쁜 쥐 외상성 뇌 손상 후 행동에 미치는 영향에 대해 변경된 보여하기 위해, 우리는 측면 유체 타악 상해, neuronal 세포 손실, gliosis, 그리고 이온 섭동 ^4를 포함한 인간의 외상성 뇌 손상의 여러 기능을 재현 외상성 뇌 손상의 일반적으로 사용되는 동물 모델을 채용 ^{- 6.}

여기 외상성 뇌 손상 유발 hippocampal 장애를 조사하는 조합 방법을 보여줍니다. 우리 접근 방식은 분석하기 위해 동물의 행동과 생화학 분석과 함께 여러 예를 생체 생리 기술을 통합해마의 포스트 외상성 뇌 손상 변경됩니다. 우리는 외상성 뇌 손상 후인지 장애를 평가하기 위해 행동 분석과 함께 실험 부상 패러다임으로 시작합니다. 전체 세포 패치 - 클램핑을 시각화 세포 분야 잠재력 녹음 및 전압에 민감한 염료 기록 : 다음, 우리는 세 가지 예를 생체 녹음 기술을 제공합니다. 마지막으로, 우리는 지역 neurochemical과 신진 대사 변경 후 외상성 뇌 손상에 대한 자세한 분석을 위해 유용 할 수 있습니다 해마의 하위 지역을 해부하는 방법을 보여줍니다.

이러한 방법은 외상성 뇌 손상 다음과 hippocampal 회로의 변경을 검토하고 이가있는 이랑과 해마의 CA1 하위 지역 (그림 1 참조)에서 발생하는 네트워크 회로 함수에서 반대 변경 사항을 조사하는 데 사용되었습니다. 각 하위 지역의 포스트 외상성 뇌 손상 변경 사항을 분석 할 수있는 능력은 외상성 뇌 손상 유발 행동 및인지 D에 참여하고있는 기본 메커니즘을 이해하는 데에 매우 중요합니다eficits.

여기에 설명 된 다원적 인 측면의 시스템은 조사가 질병 상태 (외상성 뇌 손상이 경우)에 의해 유도 현상론의 과거 특성을 밀어과 외상성 뇌 손상과 관련된 관찰 된 병리에 대한 책임 메커니즘을 확인할 수 있습니다.

프로토콜

1. 측면 유체 타악기 상해

1. 케타민과 xylazine 주어진 intraperitoneally의 혼합물을 사용하여 마우스를 마취시키다. 그런 다음 요오드 스크럽을 사용하여 절개에 대한 마우스의 머리를 준비합니다.
2. 3mm (직경 외) trephine을 사용하여 오른쪽 정수리 영역에 craniectomy을 수행합니다.
3. cyanoarylate 및 치과 아크릴을 사용하여 craniectomy 통해 보안 Luer-LOC 바늘 허브 (직경 3mm 내부).
4. 24 시간 후, 흡입을 통해 isoflurane을 사용하여 마우스를 마취시키다.
5. 일단 정상적인 호흡 이력서,하지만 마우스가 자극에 민감되기 전에, 유체 타악 부상 장치를 통해 두개골에 염분의 20 밀리 초 펄스를 제공합니다.
6. 즉시 부상 후 허브를 제거 isoflurane을 사용하여 마우스를 reanaesthetize하고, 두피가 폐쇄 봉합 해.
   샴 운영하는 제어 단계 1.5 생략과 동일한 절차를 받게 될 것입니다.

2. 행동 분석 - 에어컨, 두려움 Response

1. 에어컨, 공포 반응 (CFR) 교육하기 전에 연속 2 일에 쥐를 처리합니다.
2. 2 초에 1.5 mA 바닥 충격을 관리하기 전에 3 분을위한 컨디셔닝 실에서 개최 마우스. 추가 30 초에 챔버에 마우스를 둡니다.
3. 지연 기간 (보통 24 시간) 후, 5 분을위한 시설 챔버에 마우스를 반환합니다. 5 초 간격으로 얼어 평가합니다.
   분석의 경우 뇌 부상당한 마우스와 사기로 작동하는 컨트롤에서 두 집단에서 시간 냉동의 상대적 양을 비교로 구성되어 있습니다. 낮은 냉동 요금은 (제어에 비해) 컨텍스트 및 바닥 충격, 메모리 장애 및인지 장애의 표시 사이의 연결을 유지하는 무능력을 나타냅니다.

3. 급성 Hippocampal 슬라이스 준비

* 참고 : 벨 항아리를 사용하여 Anesthetization 만 터미널 절차 (예 : 여기에 설명 된 뇌 해부 등)에 구현 될 수있다.

1. 7 일 후부상, 인공 대뇌 척수 (aCSF) 250 ML의 자당 절단 솔루션 1 L를합니다.
2. 뇌 슬라이스 준비하는 동안 사용되는 모든 장비와 솔루션은 얼음처럼 차가워 있는지 확인하기 위해 후한 얼음을 사용합니다.
3. isoflurane 사용 마우스를 마취시키다. 신속하고 부드럽게 자당의 마우스와 곳에서 뇌를 제거합니다.
4. 한천 블록 앞의 superglue의 드롭 표면을 절삭에 트림 뇌 및 장소.
5. 350 μm 두께 코로나 조각을 잘라, 당신은 손상 hippocampal 회로와 4 ~ 5 조각을 얻을 수 있습니다.
6. 37 적어도 1 시간에 조각을 품어 ° C.

4. 세포 필드 잠재적 기록

1. 수직 풀러를 사용하여 2-5 MΩs에 붕규산 유리 전극을 당겨.
2. 전극 홀더로 챔버 및 삽입 전극의 장소 슬라이스.
3. 예를 perforant 경로 나 Schaffer 민간인 피해 등의 axonal 기관의 슬라이스에 자극 전극을 낮 춥니 다. 낮은 기록 전극모니터링 출력 성분이 전극이 동일한 Z-레벨 (깊이)에 있는지 확인하기 위해 동안 들었어요. 최대 응답이 자극을 현재의 수준을 일정하게 유지, 달성 될 때, 전극은 동일한 Z-레벨에 있습니다.
4. presynaptic 섬유 발리, 현장 세포 postsynaptic 잠재력 (fEPSP) 및 postsynaptic 인구 증가 : 결과 추적은 세 가지 구성 요소로 구성되어 있습니다. 구성 요소 분석을 더 어렵게 만드는 몇 가지 준비에 시간적 겹칠 수도 있습니다. 응답이 presynaptic 또는 postsynaptic 여부를 사이에 모호가있는 경우, APV 및 CNQX는 흥분성의 전송을 차단하는 목욕에 추가 될 수 있으며, 남아있는 모든 신호는 presynaptic 기원이 될 것입니다.
5. 입력 / 출력 곡선, 짝 펄스 녹음, 및 장기 소성 실험 : 자극 프로토콜은 세 가지 실험 유형을 생산 다릅니다.
   분석은 일반적으로 뇌 부상당한 마우스 및 사기 모두에서 fEPSP의 기울기를 비교 측정으로 구성되어 있습니다섬유 일제 사격을 측정하여 입력 강도에 대한 통제, 제어를 운영.

5. 시각화 패치 - 클램프 녹음

1. 이전에 4.2 단계로 위의 설명 된대로 기록하는 슬라이스, 전극 및 장비를 준비합니다.
2. 겉으로 만 가까이 세포와 조직에 세포에게 깊은 80 μm을 고려하는 것은 죽은 및 / 될 것입니다 또는 연결을 감소했습니다. 이 조직을 통해 아래로 이동로가 막힌되지 않도록 할 수있는 전극에 긍정적 인 압력 셀을 접근한다. 전극이 부드럽게 셀 전극과 플라즈마 막 사이에 'gigaseal'을 만들기 위해 부정적인 압력을 적용 감동합니다.
3. 전극 아래 plama 막 파열하기 위해에 부정적인 압력의 짧은 폭발을 적용하고 전체 셀 구성을 얻을 수 있습니다.
4. 증폭기를 사용하여 정전 용량 과도를 제거하고 일련의 저항을 보상. 세포의 일련의 저항에 대한 보상은 유지를 위해 필수적입니다측정을 ccurate.
5. 단세포 녹음의 두 모드는 수행 할 수 있습니다 : 현재 클램프 (측정 막 전압) 및 전압 클램프를 (막에서 이온 채널을 통해 현재의 전달을 측정).
   분석의 가능한 유형은 여러이지만 우리의 경우 대부분 뇌 부상당한 마우스와 사기로 작동하는 컨트롤 모두에서 자연 신경 전류의 속도와 크기를 정량화 biophysical 분석으로 구성되어 있습니다.

6. 전압 민감한 염료 이미징 (VSD)

1. 이전에 4.2 단계로 위의 설명 된대로 기록하는 조각과 장비를 준비합니다.
2. 50 μl 에탄올로 한 MG 디-3-ANEPPDHQ을 혼합하여 염료 재고를 준비, 호일 포장 튜브, -20 ° C.에 상점에 2 μl aliquots을 투여 aCSF에 1:200을 diluting하여 매일 염료 솔루션을 작동합니다.
3. 필터 종이를 moistened aCSF에 조각을 배양하고 16 분을위한 염료의 90 μl로 얼룩, 인터페이스 기록 챔버에서 aCSF 및 장소와 린스.
4. 빛 stimulatio을 조정응답까지 N 강도는 카메라 범위의 중간에 중점을두고 있습니다. 이미지는 일반적으로 초당 500-1,000 프레임의 속도로 획득합니다.
5. 초기 빠른 photobleaching이 안정 할 수 있도록 전기 자극을하기 전에 가벼운 자극을 200 밀리 초에 대한 트리거 셔터. 전기 사이의 대체 수집 재판은 비 자극 배경 나중에 빼기를 허용하도록, 자극, 비 전기 자극. 전에 셔터를 열어에 기록 휴식 광도 (셔터 폐쇄와 형광 읽기). 각 VSD 재판은 형광 판독 시간 "영화"로 Y 픽셀 x 픽셀됩니다. 기록 10 - 각 시험 조건 12 VSD 재판.
6. 모든 측정은 내부 픽셀 사전 전기적 자극 표준화 된 형광 변화에 수행됩니다,으로 계산됩니다 DF / F는 다음과 같습니다
   VSD 원시 취득 시험에서 휴식 빛 강도를 뺍니다. 각 시험의 각 픽셀은 해당에 대한 사전 전기적 자극 평균 값에 따라 정상화평가하고, 통일을 차감. 전기적 자극 및 비 전기 자극 시험 모두에 대해이 작업을 수행합니다. 비 전기적 자극 시험에서 평균 '의 배경 형광 "평가판을 만들고, 전기 자극 실험에서이 배경 재판을 뺍니다. 12 등 시련도 보통 공간과 잡음 비율로 신호를 개선하기 위해 시간에 제외됩니다 - 자세한 분석은 일반적으로 10 평균 수행됩니다.

7. 생물 화학 분석에 대한 지역 Dissections

1. 이전에 설명 된대로 마우스의 뇌를 제거합니다.
2. 조직 헬리콥터를 사용하여 슬라이스를 준비합니다.
3. 섹션 평면 배열, 면적 CA1과 DG를 microdissect.
4. 용해 버퍼 포함하는 프로테아제 억제제에 즉시 잠그다. -80에서 액체 질소와 저장소에 고정 ° C.

8. 대표 결과

우리 실험은 일반적으로 예상을 확인하는 행동 데이터로 시작뇌 부상당한 쥐에 존재 에드인지 적자. 이 신뢰할 수 있으며, 하나의 교육 세션을 한 테스트 세션을 필요로하는 hippocampal 부양 행동이기 때문에 우리는 문맥이 설치된 두려움 응답 테스트를 사용합니다. 그림 2에 묘사 된 데이터는 anterograde 메모리를 측정 할 수 행동 테스트를 의미하며 훈련 세션이 부상하기 전에 수행하는 경우 그러나, 테스트도 역행 메모리를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

필드 흥분성의 postsynaptic 잠재력은 (fEPSPs) 세포의 큰 인구 (그림 3A)의 순 신경 효능을 결정하기 위해 측정합니다. 우리는 일반적으로 자극 패턴의 세 가지 다른 종류의 자신의 결과와 결론을 affording 각을 채용하고 있습니다. 첫째, 일련의 단계를 통해 자극의 강도를 높임으로써, 우리는 입 / 출력 곡선을 (그림 3B / C) 만들 수 있습니다.

다음, 별도의 같은 강도의 두 stimulations를 제공함으로써. 또한, 우리는 자주 장기 potentiation (LTP) 실험을 수행, 우리가 신경 소포 릴리스 확률 잠재적 인 변경을 조사 약간의 지연 (보통 50 밀리 초)로 D. 같은 강도의 기준 응답, 간단한 고주파 자극을 (보통 100Hz) 설립 후 정상적인 자극이 재개 될 때 potentiated 신경 반응에 이르게 세포 층계를 발생 전달됩니다.

전체 셀에서 전기 활동 세포는 두 가지 모드로 기록 할 수 패치 - 고정. 전압 클램프 모드에서 실험은 앰프와 관련된 컴퓨터 소프트웨어를 통해, 욕실에 대한 언급 패치 - 고정 세포의 막 전압을 제어합니다. 이 경우 postsynaptic 이벤트를 중재 전류가 활성화 postsynaptic 수용체와 기공을 갖는 신경 전달 물질 농도 (그림 4A)의 presynaptic 출시 주파수에 대한 정보, 번호를 제공하는 기록됩니다. 현재 클램프 모드 실험에서조작 전류 주입하고 전압 응답을 측정합니다. 여기에는 액션 잠재적 임계 값과 반 폭으로 행동 잠재력의 특성을 결정하는 데 유용 할 수 있습니다. 이러한 특성은 흥분성의 또는 행동 잠재력 발사 패턴 (그림 4B)을 기반으로 억제 등의 뉴런의 기능 분류에 대한 수 있습니다. 세포의 신원을 확인하기 위해 우리는 녹화 후 루시퍼 노란색과 수지상 쪽의 유무에 의해 시각적으로 확인 된 ID로 셀을 작성하는 것이 좋습니다. (그림 4C, D).

막 전압의 변화를 측정하기 위해 전압에 민감한 염료를 사용하여 실험의 결과의 예는 그림 5에 그려져 있습니다. 이 경우, 자극 전극은 Schaffer의 담보 경로에 배치되어 지역 CA1의 결과 neuronal 활동을 분석하고 있습니다. 전압에 민감한 염료는 막 전압의 절대 값을보고, 오히려 t되지 않습니다그는 자극없이 기본 상태에서 전압으로 변경합니다. 그러나, 두 조건 (예를 들면 사기로 작동하는 대 뇌 부상) 비교 분석은 fEPSPs 또는 전체 셀 패치 - 클램프 녹음을 사용하여 측정 할 수없는 생리적 변경의 spatiotemporal 매개 변수를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

1 그림. Hippocampal 회로 다이어그램. 해마를 통해 수평 절을 참조하십시오. 해마를 통해 주요 경로는 노란색으로 표시됩니다. 이가있는 이랑의 과립 세포의 수석과 시냅스를 형성하는 이가있는 이랑에 perforant 경로를 통해 entorhinal 피질 프로젝트에서 뉴런의 axons. 그들은 CA3 뉴런의 수석과 시냅스를 형성 CA3에 이끼 ​​섬유 경로를 통해 과립 세포 axons 프로젝트. dendrit로 Schaffer의 담보 경로를 통해 CA3 뉴런 프로젝트의 axonsCA1 피라미드 세포의 에스. CA1 피라미드 세포의 axons은 subiculum를 통해 해마에서 프로젝트. 참고 : 또한 fimbria를 통해 contralateral 해마에 투영 CA3 피라미드 세포 축삭의 민간인 피해는 아닙니다. (CA1 : Cornu Ammonis 1, CA2 : Cornu Ammonis 2, CA3 : Cornu Ammonis 3, DG : 이가있는 이랑, 점선은 실선은 구조 경계를 나타냅니다, 전지 본체 레이어를 나타냅니다.)

그림 2. 대표 행동 데이터 A :. 뇌 부상당한 마우스 (FPI)와 에어컨, 두려움 응답 패러다임의 (가짜) 컨트롤 사기로 작동 사이의 동결 속도의 차이를 묘사 행동 데이터입니다. 교육 후 24 시간을 발생 시험 기간으로, 6 ^{일 일} 다음과 같은 부상에 발생했습니다. (** 존재라는 증거 P <0.01).

그림 3. 대표 세포 녹화 데이터 A :. 현장 흥분성의 시냅스 후 전위 (fEPSP) 영역 CA1에서 녹음의 예라고 할 수 있습니다. 제 1 하향 편향은 presynaptic 섬유 발리, 마지막으로 fEPSP 다음에 자극의 유물입니다. B : 입력 / 출력 곡선은 CA1 다음과 같은 유체 타악 상해 (FPI)의 순 신경 효능 감소 묘사. C : 입력 / 출력 곡선 FPI 다음과 같은 이가있는 이랑의 순 신경 효능의 증가 (DG)을 묘사. (* 존재라는 증거 P는 <0.05). 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

4 그림. 대표 전체 세포 패치 - 클램프 데이터 A :. 자연의 예CA1 피라미드 세포에서 postsynaptic 전류 (sEPSC)를 흥분성의. B : CA1 피라미드 세포 (상단 추적)과 빠른 솟고 CA1 interneuron (하단 추적)에서 작업을 잠재 기차의 예. C : 루시퍼 노란색의 예 CA1 억제 interneuron을 가득 채웠다. 수지상 쪽 (위쪽 패널)의 부재를 확인합니다. D : 루시퍼 노란색의 예 CA1 피라미드 뉴런을 가득 채웠다. 수지상 쪽 (위쪽 패널)의 존재를 확인합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 5. 대표 전압 민감한 염료 영상 자료를 A :. 해부학을 표시 할 표시 마우스 코로나 hippocampal 슬라이스. (DG : 이가있는 이랑, CA1 : Cornu Ammonis 1) B : 수입 성의 Schaffer의 부수적 인 자극 후 지역 CA1 14 밀리 초를에 흥분성의 활동을 나타내는 빨간색 픽셀 노란색. 에서 레드노란색은 낮은,하지만 여전히 상당한 탈분극을 나타내며 더 탈분극을 dicates. C : 지역 CA1의 억제 활동의 사이트를 대표하는 블루 픽셀 56 밀리 초는 B.의 어두운 파란색에 표시된 동일한 수입 성의 Schaffer의 부수적 인 자극 후 더 hyperpolarization을 나타냅니다.

토론

위에서 설명한 각 기술은 관찰 된 행동 적자의 원인이 기본 메커니즘의 더 큰 이해에 기여하고있다. 각 방법에서 얻은 고유 한 정보를 결합하여 우리가 더 정밀도와 생물학적 메커니즘을 검토 할 수 있습니다.

측정 fEPSPs는 뉴런의 대형 spatially 정의 영역의 순 신경 효능을 정량화하는 데 유용합니다. 또한 시냅스 소성를 받아야하는 세포의 그룹의 가능성에 대한 정보를 제공 ?...

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