자가 면역 탈수 초화의 약리 개입에 대한 CNS 보호 대 결정 면역 시스템 억제

요약

This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.

초록

A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.

서문

다발성 경화증 (MS)는 주로 초기에 질병에있는 뇌의 백질 지역에서 염증성 병변을 특징으로한다. 장기간의 진행 후, 회백질 위축은 MRI 영상 검출 및 신경 퇴행성 질환의 위상을 표시한다. 반응성 신경교 증, 탈수 초화 및 백질의 축삭 손상은 CNS-침투 면역 세포에 기인한다. 현재 CNS의 신경 퇴행을 예방 직접 역방향 또는 MS에서 사용되는 치료 없음 - 대신, CNS로 T 세포 활성화 및 / 또는 침투를 감쇠하여 염증을 감소하지 않는다. 이 MS에 대한 치료는없고 현재 치료를 사용하여 환자가 질병의 진행을 계속 발생하기 때문에, 탈수 초화 및 신경 세포 손실을 방지 약물의 발견은 매우 중요하다. 즉, CNS에 감소 손상이 - -의 S 보이는 그러나, 면역 세포에 작용 및 CNS에 그 구별하는 결과로, 실험적으로 어려울 수 있습니다에 관계없이 발생되는 메커니즘의 AME. 따라서, CNS 보호의 평가는 질병 메커니즘에 미치는 영향 약리 에이전트를 결정하기 위해 주변에 면역 세포와 면역 세포의 증식을 CNS는-침투의 평가와 협력해야합니다.

실험자가 면역 뇌척수염 (EAE)은 현재 MS ^1-4 치료 용 약물의 발견에 대한 직접 책임 염증성자가 면역 질환의 잘 확립 된 동물 모델이다. 마우스는 종종 C57BL / 6 마​​우스는 유전자 변이체의 가용성에 따라 인기 균주 인 상태 EAE 사용된다. EAE로 유도 C57BL / 6 마​​우스는 10 일 후 유도 주위에 발병 만성 질병의 진행을 나타낸다. 척수 실질 및 소뇌 피질 침투 실질 ⁵ 침윤의 유무,이 동물의 조직 병리학 적 특성이다. ㄴ에서 또한 대뇌 피질의 병변 및 탈수 초화비는 C57BL / 6 마우스에서 상대적으로 결석 질환 ^6-9의 특징이다. 재발 완화 성 질환 및 MS ^(10)에서 나타나는 것과 유사한 뇌와 척수 모두에서 발견되는 병소가 SJL 마우스를 사용할 때 가능 따라서 바람직하다.

면역 세포는 CNS에 도달하지 않을 경우, 치료는 신경 세포로 분류 될 수 없다. 따라서,이 프로토콜은 이전에 ¹¹ 있듯이 뇌, 척수 및 EAE 마우스에서 비장의 유세포 분석의 사용은, 면역 세포 상기 CNS에 침입하여 주변의 면역 세포의 증식에 대한 치료 효과를 확인 할 수있다. 범위와 신경의 성격을 결정하는 CNS 조직의 면역 조직 화학적 분석도 설명한다. 이들 방법을 조합하면 CNS 였는지 PR 면역 세포가 활성화 된 면역 세포가 CNS 입력 여부를 주변에 확산되었는지 여부의 판정이 가능하고,염증이나 손상 otected. 신경 보호 효과가 면역 체계에 영향에도 불구하고 의심되는 경우, 실험자는 CNS가 발생한으로 치료가 면역 세포의 침윤 후 시작 시간을 변경할 수 있습니다.

여기서는 활성 EAE, MS의 T 세포 매개 된 동물 모델의 서로 다른 모델들을 사용하는 프로토콜을 제공하고, 다른 측면에 실험 요법의 효능을 결정하는 질병 중 다양한 시간 점에서 면역 조직 화학 결합 분석 유동 세포 계측법 MS의 발병 기전. 이 방법은 면역 세포 증식 및 CNS 보호 대 침투에 영향을 구별 약물이 질병의 발병 기전에 작용하는 방법을 쉽게 좁힐 만드는 연구를 도움이 될 것입니다.

프로토콜

마우스를 포함하는 실험 절차는 관련 기관 및 정부 규정을 준수해야합니다. 본 연구의 경우, 마우스를 보관하고 버밍엄 기관 동물 관리 및 사용위원회 지침에서 건강과 알라바마 대학의 국립 연구소에 따라 처리.

1. EAE 유도 및 채점

1. C57BL / 6 마우스 ^{11 ~ 13} 또는 ^{10, 11} SJL 마우스에 EAE를 유도는 이전 ^{13 설명했다.}
   참고 : 실험자들이 연구 문제 (더 세부 사항에 대한 논의를 참조) 모델 이상을 선택해야합니다.
2. 기록 점수는 매일 앞서 7 일 후 유도을 시작으로 각 마우스 ^{(11)을 설명했다.} 치료 그룹 사이의 시간 동안 일일 평균 점수를 비교합니다.

2. 치료

1. 치료는 면역 세포의 침윤 또는 증식에 영향을 미치는 여부를 결정하기 위해 질병의 발병하기 전에 EAE 마우스를 취급합니다.
   1. 나를 치료를 선택전달 THOD는, 치료 횟수, 약물의 혈액 - 뇌 장벽의 투과성, 반감기, 투여 량을 고려하고있다.
      주 : EAE는 혈액 - 뇌 장벽의 투과성을 증가시키고, 약물은 건강한 동물의 수 없을 것이다 CNS에 도달 할 수있다. EAE 임상 점수보고 용량 - 반응 곡선에 대한 실험을 실시하는 것은 약물의 적절한 용량을 선택하는 데 도움이 될 수 있습니다. 차량 제어 장치는 약물 처리를 병렬로 수행한다. 대안 적으로, 조건부 녹아웃 마우스는 한배 새끼 컨트롤로서 사용될 수있다.
   2. 이 실험을 위해 SJL 또는 C57BL / 6 마​​우스를 사용합니다. 전달의 선택 방법을 사용하여 증상의 발병하기 전에 초기 EAE 유도 (7 일) 후 쥐를 치료​​.
   3. 희생 단계 3.1 시간에 가장 높은 임상 점수의 평균을 기준으로 하위 단계에서와 같이, 질병의 피크 (약 15 일째)에 마우스를 해부하다.
   4. 행동은 면역 세포 infiltrati를 결정한다 (단계 3.2로) 마우스 척수에 유동 세포 계측법및 비장에 (단계 3.3)에서와 CNS에의하면 주변의 면역 세포 증식을 결정한다. 별도의 마우스에서 (4 단계)를 실시 면역 조직 화학은 성상 세포 및 미세 아교 세포, 및 수초의 보존을 정량화한다.
2. 면역 세포의 침윤이 발생한 후 치료는 중추 신경계를 보호 여부를 결정하기 위해 질병 발병 후 EAE 마우스를 취급합니다.
   1. 단계를 반복 2.1.1.
   2. 이 마우스는 측정 가능한 질병의 관해를 가지고,이 실험 SJL 마우스를 사용합니다. 평균 임상 스코어에 의해 측정 된 (a 다음 재발의 피크, 원하는 경우 또는) 질병에서의 제 1 피크 기간 동안 마우스를 치료.
   3. 원하는 시간 후 EAE 유도에 쥐를 희생. 침투가 이미 발생하기 때문에, FACS 분석에 의해 침투를 측정하기 위해 유용 할 수 없다. 그러나 면역 세포 침윤 불구 CNS 보호가 존재 하는지를 판정하기 위하여, 반응성 신경교 증 및 미엘린 정량화 척수 걸릴.

3. 유동 세포 계측법 분석

1. 해부
   1. 동물의 ID 및 조직의 유형에 따라 동물성 라벨 세 15ml의 원뿔형 튜브 (뇌 하나 척수 하나, 비장 하나)을 함유 하였다. 얼음의 전체 절차에 대해 별도의 튜브에있는 모든 조직을 유지합니다.
   2. 3 분 - 비장의 FACS 분석의 경우, 2 분 내지 약 15 %의 용기 부피의 유속으로 이산화탄소를 사용하여 질환 (~ 15 일째 이후 EAE 유도)의 피크에서 쥐를 희생. 호흡 부족으로 안락사를 확인합니다. 각 마우스의 희생 후, 개별적으로 비장 ¹⁴ 곳을 제거 빙냉 RPMI가 2 % FCS, 100 IU 페니실린, 100 μg의 / ml의 스트렙토 마이신이 보충 함유한다 (단계 3.1.1)에서 15ml의 원뿔형 튜브 라벨 ( 프로토콜을 통해 "미디어")라고도합니다.
   3. 뇌와 척수의 FACS 분석을 위해, circulatin를 해제 수술 가위로 마우스의 우심방을 절단하여 심장 관류를 수행g 혈액과 얼음처럼 차가운 PBS 10 ㎖로 충전 된 주사기에 연결된 바늘로 좌심실을 관통. 천천히 10 ml의 PBS를 주입.
   4. 마우스의 머리를 잘라하고 수술 가위로 두피의 중간 선을 잘라합니다. 껍질은 다시 손이나 집게로 피부는은 시작 지점과 척수의 엔트리 포인트를 사용하여, 수술 가위로 두개골의 중간 선을 잘라합니다.
   5. 마이크로 집게로 두개골을 벗겨 뇌를 무료로 특종을 사용합니다. (단계 3.1.1에서) 라벨 15 ML 원뿔 튜브를 포함하는 미디어에 두뇌를 놓습니다.
   6. 포셉, 외과 가위로 마우스의 피부를 제거하고 수술 가위를 사용하여 마우스를 내용 만. 사지, 꼬리, 갈비뼈를 잘라, 수술 가위로 어떤 주위의 근육은 척추를 해제 할 수 있습니다.
   7. 수술 가위로 약 5 거의 동일한 조각으로 척추를 잘라 내기 및 지혈제로 한 조각의 한쪽 끝을 집어 넣은 다음 다른 지혈제의 t를 사용오 척수 상단에서 좋다고 할 때까지 조각을 따라 이동, 압박을 계속합니다. 척추의 각 부분에 대해이 작업을 반복하고 개별로 코드를 배치, 미디어를 포함하는 15 ㎖ (단계 3.1.1에서) 원뿔 튜브를 표시.
2. 뇌와 척수에서 면역 세포의 침윤의 평가
   1. 멸균 가위를 사용하여 작은 조각으로 뇌와 척수를 잘라. 미디어 여과기를 세척하는 동안 새로운 50 ML 튜브에 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 3 ML의 주사기에서 플런저와 크러시. 미디어 50 ml의 볼륨에 각 튜브를 가져옵니다. 펠릿 세포 5 분 453 XG에 원심 분리기.
   2. 대기음 상등액 40 % 밀도 구배 매체 4 용액에 재현 탁 펠릿. 조심 구배 적당한 레이어를 위해 원추형 튜브의 벽에 아주 천천히 새로운 15ml의 원뿔형 튜브 피펫에 70 %의 농도 구배를 2 ㎖의 위에 세포를 함유하는 40 %의 농도 구배를 오버레이. 실온에서 20 분에 대한 796 XG에 스핀브레이크 아웃.
   3. 조심스럽게, 1 ml의 전송 피펫 그라디언트에서 상부 수초 층을 제거하고 새 15 ML 원뿔 튜브에 1 ㎖의 전송 피펫 및 전송과 인터페이스에서 가능한 세포를 제거합니다. 10 분 동안 448 XG에 미디어와 원심 분리기 15 ml의에 튜브를 가져옵니다.
   4. 재현 탁의 200 μL 미디어에서 펠렛과 (자신의 우물에 가서 각 동물의 각 샘플) 96 웰 둥근 바닥 판의 한 우물에 배치합니다. 5 분 동안 410 XG에 접시를 원심 분리기.
   5. restimulation 배지 200 μL의 상등액 및 재현 탁 펠릿을 톡 (RPMI는 10 % FCS로 보충 된, 100 IU / ml의 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 2 mM L- 글루타민, 1X 비 필수 아미노산, 1mM 피루브산 나트륨 및 β 머​​ 캅토 에탄올 55 μM, 50 ng의 플러스 / ㎖ 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA), 750 ng의 / ㎖ 이오 노마 이신과 단백질 수송 억제제 Brefeldin A). 4 시간 37 ^O C에서 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
      참고 : PMA와 ionom위해서 모든 T 림프구에 관계없이 자신의 항원 특이성의 활성화에 ycin restimulation 결과는 주어진 조직 내의 각 T 세포 서브 세트의 총 수를 평가한다. 그러나, 항원 특이 적 이펙터 T 세포 반응은 Brefeldin ^15,16의 존재 MOG 펩티드 restimulating 세포를 포함한 다양한 방식으로 평가 될 수있다.
   6. CNS CD4 ⁺ T 세포의 표현형의 평가
      1. 배양 후, 5 분 동안 410 XG에 원심 분리기 (단계 3.2.5에서) 96 - 웰 둥근 바닥 판, 상층 액을 가볍게. 다음 염색 단계를 모두이 플레이트에서 수행된다.
      2. 5 분 동안 410 XG에 2 % FCS와 원심 분리기 200 μl의 PBS에 세포를 씻으십시오. 상층 액을 가볍게 200 ㎕의 PBS가 10 된 Fc 블록 (클론 2.4G2)와 2 % FCS를 포함와 세포 배양 - 얼음에 15 분.
      3. (50)에 5 분 동안 410 XG에 뜨는 오프 영화, 그리고에 resuspend 펠렛을 세포 외 얼룩, 원심 분리기 세포를 시작하려면 &# 956, 표면 얼룩 칵테일 L (1 : 200, 1 μg의 / ㎖) CD4 대해 형광 표지 된 항체를 포함 TCRβ 15 PBS에 희석 (1 : 200, 1 μg의 / ㎖)과 생존 염료 (500 1) 얼음에 분. 뜨는 오프 5 분, 영화 410 XG에 원심 분리기 세포. 세척 세포는 5 분 동안 410 XG에 원심 분리기 200 μl의 PBS에 2 배.
      4. 외 오염을 제거한 후, 세포 염색 하였다 고정 / permeabilization하여 세포 내 염색 절차 개시.
         1. 4 박 ^O ℃에서 30 분에 대한 (참조 자료 목록 제조업체의 지침에 따라) Foxp3의 전사 인자 염색 시약 ⁽¹⁷⁾ / Permeabilize 하시려면 세포를 뜨는 떨어져, 영화를 시작하고 해결하려면
         2. 5 분 동안 410 XG에 키트와 원심 분리기 플레이트에서 150 μL의 permeabilization 버퍼에 세포를 씻으십시오. (1 IL-17A에 대한 형광 표지 - 항체 50 μL의 permeabilization 버퍼에 뜨는 및 얼룩 세포를 쓸어 넘기: 200, 1 μg의 / ㎖), IFN-γ (1 : 200, 1 μg의 / ㎖) 및 Foxp3의 (1 : 200, 얼음에서 30 분 동안 PBS에서 희석하여 2.5 μg의 / ㎖).
         3. 뜨는 오프 5 분, 영화 410 XG에 원심 분리기 세포. 과량의 항체가 다음 5 분 동안 410 XG에 원심 분리기 200 μL의 permeabilization 버퍼에 3 배 씻어 제거합니다. 200 ㎕의 PBS에 뜨는 및에 resuspend을 가볍게.
         4. 이전에 각 분자를 발현하는 세포의 비율을 평가하기 위해 ¹¹ 설명 ⁺ TCRβ ⁺ 세포로서 라이브 CD4에 게이팅, 유동 세포 계측법에 의해 세포를 분석 할 수 있습니다. CD4 ⁺ T 세포의 표현형 각각 마우스 당 세포의 수를 결정하는 혈구 ⁽¹⁸⁾ 또는 다른 검증 방법을 사용하여 세포를 카운트.
         5. 얻어진 데이터를 사용 EAE 발병의 보호에 중요한 역할을하는 이들 집단에 특히 초점을 백분율 각 마우스의 뇌와 척수 침투 CD4 ⁺ T 세포의 수를 계산¹⁹ : IL-17A ⁺ IFN-γ ^- IL-17A ⁺ IFN-γ의 ^+, IL-17A ^- IFN-γ의 ^+, Foxp3의 ^+.
3. 말초 T 세포의 증식 및 활성화 평가
   1. 60 X 15mm 배양 접시에서 젖빛 유리 슬라이드와 비장 크러시. 세포를 일시 중단 미디어를 사용하여 15 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 놓습니다. 5 분 동안 448 XG에 미디어와 원심 분리기 세포를 15 ml의 튜브를 입력합니다.
   2. 이 용액에 대기음 미디어 재현 탁 펠릿 ACK 약 3 분 동안 적혈구를 용해시키기 위해 RT에서 용균 완충액.
   3. 새로운 튜브에 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 15 ml의 미디어와 함께 볼륨 및 변형에 튜브를 가져옵니다. 원심 분리 세포들은 5 분 동안 448 XG에 2 ㎖의 배지에서 뜨는 및 재현 탁 대기음.
   4. 기-67 염색으로 주변 CD4 ⁺ T 세포 증식의 평가
      1. EQ의 작은 나누어지는 (일반적으로 200 μl를) 배치96 웰 둥근 바닥 판의 개별 우물 (샘플 당 하나)에 3.3.3에서 비장 세포의 uivalent 번호.
      2. 뜨는 오프 5 분, 영화 410 XG에 원심 분리기. 2 % FCS를 반복 원심 분리를 포함하는 200 ㎕의 PBS에 재현 탁. PBS가 된 Fc 블록 (클론 2.4G2)와 2 % FCS를 포함하여 상층 액과에 resuspend 세포를 가볍게 10 부화 - 얼음에 15 분. 세포 외 얼룩 단계를 반복 3.2.6.3하십시오.
      3. 외 오염을 제거한 후, 세포 염색 하였다 고정 / permeabilization하여 세포 내 염색 절차 개시.
         1. 단계를 반복 3.2.6.4.1.
         2. 뜨는 오프 5 분, 영화 410 XG에 원심 분리기 세포. 세포를 씻고 5 분 동안 410 XG에서 원심 분리 키트에서 200 μL의 permeabilization 버퍼 배일. 30 분 : 안티 기-67 항체 (200, 1 μg의 / ㎖ 1) 50 μL의 permeabilization 버퍼에 뜨는 및 얼룩 세포를 쓸어 넘기십시오.
         3. 410 XG에 기용 원심 분리기 세포뜨는 오프 R 5 분, 영화. 세포를 씻고 5 분 동안 410 XG에서 원심 분리 키트에서 200 μL의 permeabilization 버퍼 배.
         4. 상층 액을 가볍게 씻어 세포를 200 ㎕의 PBS에 1 배에서 5 분 410 XG에 원심 분리기. 다음 %를 기-67 ⁺ 세포를 평가, 이전에 ¹¹ 설명 ⁺ TCRβ ⁺ 세포로서 라이브 CD4에 게이팅, 유동 세포 계측법에 의해 세포를 분석 할 수 있습니다.
   5. 주변 CD4 ⁺ T 세포의 표현형의 평가
      1. 5 분 동안 410 XG에 96 웰 둥근 바닥 판 (샘플 당 하나의 웰)과 원심 분리기에 (단계 3.3.3에서) 세포를 200 μl를 놓고 3.2.5에서와 같이 다시 자극한다.
      2. 4 시간 동안 37 ^℃로 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 단계 3.2.6의 서브 스텝과 동일한 염색 절차를 수행한다. 3.2.6.4.4-3.2.6.5.5에서와 같이 유동 세포 계측법에 의해 세포를 분석 할 수 있습니다.

4. 면역 조직 화학의D의 정량화

1. 조직 준비
   1. C57BL / 6 마​​우스 또는 평균 임상 점수 피크 기간 동안 질병의 만성 단계에서, EAE 유도 (보통 ~ 일 30 이후 어느 시점에서 3 단계와 하위 단계에서 사용되는 것과에서 별도의 실험에서 EAE 마우스를 희생 다음 단계에 따라 SJL 마우스는) 반응성 신경교 증과 탈수 초화의 범위를 결정합니다.
   2. 응답의 부족을 찾고, 집게를 사용 꼬집어 2.5 %의 이소 플루 란과 97.5 %의 산소와 마우스를 마취하고 부드러운 발가락과 마취의 적절한 깊이를 확인합니다. 단계 3.1.3에 설명 된대로 transcardiac 관류를 수행합니다. 눈에 심각한 손상을 줄 수 있습니다, 파라 포름 알데히드는 피부와 폐 자극하고, 암을 일으킬 것으로 의심된다. ​​좌심실에 PBS를 주입 한 후, PBS주의에서 4 % 파라 포름 알데히드 10 ㎖를 주입하는 새로운 주사기를 사용합니다. 흡입, 섭취를 피하고, 피부와 눈에 문의하십시오. 관류는 흄 후드에서 수행해야합니다.
   3. 3.1.6 - 3.1.4 단계에 설명 된대로 뇌와 척추 열을 제거합니다. 척수의 직선 정렬을 보장하기 위해 문자열 지팡이 척추 열을 묶어.
   4. PBS에서 약 50 ml의 4 % 파라 포름 알데히드와 동물의 ID로 표지 원뿔 튜브 하룻밤 게시-해결하기 위해 50 ㎖에 섬광 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드의 약 20 ㎖로 동물의 ID로 표지 유리 병 및 척수에서 뇌를 넣습니다.
   5. , 머리를 cryoprotect 1X PBS의 30 % 자당에서 4 ^℃로 3 1X PBS에서 시간과 상점을 씻어합니다. 뇌가 컨테이너 (약 3 일)의 바닥에 드롭 할 수 있습니다.
   6. ~ 7.8의 pH로, ~ 1X PBS에서 3 회 세척하고 1X PBS 0.5 M EDTA의 (a 마우스 척수 약 50 ㎖) (pH가 될 것이다부터 대량으로 배치하여 10 척주로부터 칼슘을 제거 2 6 N 염산)와 함께 - 삼주 뼈는 더 이상 딱딱한 없을 때까지. 단계 4.1.5에 따라 척추를 Cryoprotect.
   7. 포함 두뇌와곧 그들의 용기의 바닥에 드롭으로 아래의 하위 단계에 따라 OCT에서 척추 열입니다.
      1. 1X PBS에서 1 부 30 % 자당 2 부품의 OCT 혼합물 확인 (예를 들어, 1X PBS 15 ml의 30 % 자당을 추가로 30 ml의 10월).
      2. 그것은 전체 ½에 관한까지 포함 금형 (22 X 22 X 20mm의 두뇌 및 척수 22 X 30 X 20mm)에 10월 / 설탕 혼합물을 추가합니다.
      3. 면도날을 사용하여 6 동일 크기의 조각으로 척추 열을 잘라 관상 척수 부분에 대해 앞으로 직면 22 X 30 X 20mm 포함 금형에 배치합니다. 앞으로 직면 22 X 22 X 20mm 금형으로 전체 두뇌를 놓습니다.
      4. 조직을 커버하고 1 시간 동안 앉아 있도록 10월 / 설탕 혼합물을 추가합니다. 그래서 거품 탈출 할 수 있습니다. 이 시간 동안, 플래시 동결에 대한 삽입 금형을 보유 할 수있는 접시에 2 메틸 부탄을 추가합니다. 드라이 아이스에 접시를 놓고 멋진 사전 다룹니다.
      5. 교류의 내부 -80 ^℃로 드라이 아이스 및 저장에 2 메틸 부탄의 금형을 플래시 동결ontainer 탈수를 방지합니다.
   8. 준비가되면, 섹션 그라 이오 스탯 16 μm의에서 조직과 대전 슬라이드에 탑재합니다. 각 뇌와 척수를위한 슬라이드에 매 10 ^{번째 섹션을} 착용 할 것 (예를 들어, 등등 1 부 (1), (11)이있을 것이다 민 (21), 및 2 항, 12해야합니다 2 슬라이드, 22 등). 상점은 -80 ^℃로 슬라이드 또는 바로 염색을 위해 사용합니다.
2. 반응성 신경교 증 및 수초를위한 염색
   1. 준비가되면 염색, 동일한 (또는 가능한 한 유사) 지역의 모든 동물에 대한 얼룩 당 뇌와 척수를위한 하나의 슬라이드를 각각 선택합니다. 뇌의 경우, 뇌량과 cingulum 번들을 보여주는 슬라이드를 선택합니다.
   2. 장소는 7 분 동안 70 ^℃로 가열 블록에 조직과 슬라이드. 7 분 후, 열 블록을 끄고 슬라이드가 다른 10 열 블록에 식을 수 있도록 - 15 분. 이 염색 과정 중에 슬라이드의 탈락 조직 절편을 방지.
   3. 워시는 5 분 동안 (표면 항원을 표적 항체) (세포 내 항원에 대한) 0.1 % 비이 온성 세제 또는 1X PBS와 1X PBS 3 회 각 슬라이드.
      참고 :이 프로토콜에 사용되는 항체가 세포 내이기 때문에, 비이 온성 세제는 다음 단계에서 사용됩니다. 슬라이드이 단계 후 완전히 건조하도록 허용하지 마십시오.
   4. 용기에 슬라이드를 놓고 구연산 완충액 pH 3.0 커버. , 구연산 완충액을 물 100 ㎖의 최종 부피 0.192 g, 무수 구연산을 추가합니다. 아래의 경우 pH가 3.0 이상 또는 NaOH를하는 경우 아세트산으로 pH를 조정합니다.
   5. 30 분 37 ^O C에서 슬라이드를 품어 5 분 동안 0.1 % 비이 온성 세제로 1X PBS로 3 회 세척한다.
   6. 원 소수성 장벽 펜 조직 주변 영역과 가습 챔버 슬라이드를 배치 (예를 들어, 젖은 종이 타월을 함유하는 슬라이드 박스). 조직에 버퍼를 차단 추가합니다. RT에서 30 분 동안 인큐베이션.
      참고 : 버퍼를 차단하는 1X PBS로 구성0.3 % 비이 온성 세제 및 이차 항체, 즉, Iba1에 대한 미엘린 염기성 단백질 (MBP) 및 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP), 염소 혈청에 대한 말 혈청의 호스트에 따라 적절한 혈청 (5 %) 플러스.
   7. 슬라이드를 버퍼 및 기본 항체를 추가 차단 톡​​ (1 : 1,000 희소 돌기 아교 세포 0.2 μg의 / ㎖ 염소 항 - 수초 기본 단백질, 1 : 성상 교세포 1,000 또는 1 μg의 / ㎖ 3 μg의 / ㎖ 마우스 방지 GFAP, 또는 1 : 750 또는 적합한 차단 버퍼에 희석 0.67 μg의 / ㎖ 토끼 미세 아교 세포에 대한 항 Iba1) (동그라미 영역 단계 4.2.6)를 참조하십시오. 가습 실 4 ^O를 C 하룻밤에 둡니다.
   8. 슬라이드를 버퍼 5 분 동안 0.1 % 비이 온성 세제로 1X PBS에서 슬라이드 3 회 씻어 차단에 톡 항체.
   9. 이차 항체를 추가 (1 : 200 MBP와 GFAP, 또는 바이오틴 염소 Iba1 안티 - 토끼 7.5 μg의 / ml의 바이오틴 말 항 - 마우스) 적절한 차단 버퍼에 희석 (참조 인트동그라미 영역에 페이지 4.2.6) 및 실온에서 1 시간의 가습 챔버에서 부화 슬라이드를 둡니다.
   10. 슬라이드를 버퍼 5 분 동안 0.1 % 비이 온성 세제로 1X PBS에서 슬라이드 3 회 씻어 차단에 톡 항체.
   11. 사용하기 전에 immunoperoxidase에 아비딘 - 비오틴 - 퍼 옥시 다제 복합체 (ABC) (자료 목록 참조) 30 분을 준비하고 4.2.12 필요한 때까지 진탕 기에서 교반. 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 급냉 10 분 동안 원으로 둘러싼 영역을 메탄올 0.3 % H ₂ O _2를 추가한다.
   12. 슬라이드 오프 톡 솔루션 및 1X PBS에서 다음 5 분 동안 0.1 % 비이 온성 세제로 1X PBS 또는 1X PBS에서 2 회에 1 시간을 씻는다. 30 분 동안 원으로 지역에 ABC 시약을 추가합니다.
   13. 5 분 동안 물에 톡의 슬라이드 오프 용액 5 분 동안 1X PBS로 3 회 세척 한 후 2 번. 3,3'- 디아 미노 벤지딘 (DAB) 솔루션을 (재료 목록 참조) 섹션을 충당하기 위해 추가합니다.
       참고 :이 단계는 감지 최적의 관찰하는 현미경이 필요합니다이온 염색 시간과 슬라이드에 같은 시간에 대해이 작업을 수행해야합니다 비교합니다.
   14. 워시는 5 분마다 물에 3 번 슬라이드. 물 70 % 에탄올, 물, 95 % 에탄올, 물에 100 % 에탄올, 50 % 자일 렌 및 50 % 에탄올, 100 % 크실렌 : 2 분마다 다음 방법으로 배치하여 조직을 탈수. 지성 설치 매체와 슬라이드에 커버 슬립을 밀봉합니다.
   15. 이전에 이바-1 및 GFAP에 대한 항체를 사용하여 반응성 신경교 증을 평가하기 위해 ¹¹ 설명 된대로 또는 면역 형광 염색을 수행합니다.
   16. 4 배, 0.13 NA의 목적으로 (DAB를 사용하여 각각의 항체로 염색) 각 척수 부분의 이미지를 가지고 티파니로 이미지를 저장합니다. 또는, 20 배, 0.50 NA 목표를 사용하여 왼쪽 또는 오른쪽 뇌 반구의 뇌량과 cingulum 번들의 이미지를 가지고 티파니로 이미지를 저장합니다. 뇌 병변의 부하의보다 포괄적 인 결정을 위해, 모두 hemispher를 포함하는 유용분석에 말이지.
3. 반응성 신경교 증에 대한 평균 비율 영역을 측정 (Iba1 및 GFAP 염색)
   1. 다운로드 NIH ImageJ에 (http://imagej.nih.gov/ij/)와 컴퓨터에 열려. ImageJ에 소프트웨어에서 열기 메뉴 문자열 파일> 사용 단계 4.2.16에서 이미지를 선택합니다. 메뉴 바의 "다각형 선택"도구를 사용하여 영역을 그립니다. 척수의 경우, 전체 부분을 추적; 뇌, 뇌량과 cingulum 번들. 이미지> 유형으로 이동하고 클릭하여 16 비트 이미지를 변환 "16 비트."
   2. 드 노이즈> 프로세스 배경 빼기와 배경 (HTTP에서 ImageJ에 사용자 설명서를 참조하십시오의 일부가 아닌 가장 큰 객체의 최소 크기에 "롤링 볼 반경을"설정으로 이동하여 이미지를 : //rsbweb.nih .GOV / IJ / 문서 / 가이드 / 146-29.html).
      참고 : 이바-1 염색의 4 배 이미지를 위해 우리는 4.0 사용하고 GFAP에 대해 우리는 50.0를 사용하지만,이 숫자는 이미지 확대 및 염색 INT에 따라 달라질 수 있습니다ensity.
   3. "슬라이딩 parabloid"을 확인하고 "OK"를 클릭합니다. > 임계 값을 조정합니다> 이미지로 이동 ... 슬라이딩 막대를 사용하여 낮은 임계 수준 (상단 바)를 설정합니다. 포함은 해당 휴대이다 염색 및 이미지를 일관합니다. 어두운 배경 (만 형광 염색에 적용)와 이미지를 들어, "어두운 배경"상자가 선택되어 있는지 확인합니다.
   4. > 설정 측정 분석 ... 그리고 "지역의 일부"를 선택로 이동 (관심 영역 내에서 역치 영역의 비율을 제공합니다). "임계 값에 대한 제한은"선택을 취소하고 "디스플레이 레이블이"선택되어 있는지 확인합니다. 완료되면 "OK"를 클릭합니다.
   5. 측정을 얻으려면> 측정 분석로 이동합니다. A "결과"팝업 상자가 나타납니다이 데이터는 다른 프로그램에 그대로 저장하거나 복사 할 수 있습니다. 분석을 위해, 치료 그룹 사이 "지역 분획"값을 비교.
4. 옵트로 MBP 염색의 정량iCal의 밀도
   1. 단계 4.3.1에 ​​설명 된대로 열기 이미지는 관심의 영역을 그려. > 설정 측정 분석으로 이동 ... 선택 (픽셀 수로 나눈 선택에서 회색 값의 합) "회색 값을 평균". "임계 값에 대한 제한은"선택을 취소하고 "디스플레이 레이블이"선택되어 있는지 확인합니다. 완료되면 "OK"를 클릭합니다.
   2. 측정을 얻으려면> 측정 분석로 이동합니다. 는 "결과"팝업 상자가 나타 관찰한다. 이 데이터를 복사하거나 다른 프로그램에 복사로 저장합니다.
   3. 분석을 위해, 다른 프로그램에 복사 및 붙여 넣기 값. OD = ₁₀ 로그 (255 / 회색 값을 의미) : 공식을 사용하여 광학 밀도 (OD)로 평균 회색 값을 변환합니다.

결과

여기, 우리는 약리 에이전트에 의해 CNS 보호를 제공하는 경우 이해 EAE의 두 가지 모델을 사용하거나 CNS-침투 T 세포를 약화 또는 염증 면역 세포의 침윤의 공격 동안 수초와 축삭 손상을 방지 할 수있다. 면역 세포의 침윤과 질병의 병리는 주로 척수 (그림 1A)에서의 위치 치료제가 척수에 면역 세포 침투를 방지 있는지 확인하려면, 만성 EAE의 C57BL / 6 마우스 모델을 사용한다. 치료 약물이 CNS, 뇌와 척수 (그림 1B) 모두에서 질병의 병리를 보여줍니다 사용되는 재발 - 완화 성 EAE의 SJL 동물 모델에 면역 세포의 침입 동안 CNS 보호 기능을 제공하는지 확인합니다.

임상 평가

관련 임상 평가는 일반적인 내용은 다음 루 브릭 (그림 1 항에 만들어진C) 또는 비정형 (그림 1D) EAE. 전형적인 임상 질환의 경우, 0의 점수는 더 이상 동작하지 않습니다. 꼬리의 기지에 의해 선택하면, 꼬리는 (많이 로터 등) 빠르게 회전 할 수 있으며, 뒷다리는 벌리됩니다. 하나의 임상 점수는 꼬리의 기부에서 마우스를 해제함으로써 결정될 수있다 부분적 림프 테일이다. 정상 헬리콥터와 같은 회전 약화 또는 부재, 및 꼬리의 부분을 완전히 림프 일 수있다. 꼬리 마비의 정도를 결정하기위한 유용한 방법은 부분적으로 마비 꼬리 그렇게 할 수없는 것 중에 unparalyzed 꼬리는 일반적으로 손가락의 주위에 말려있는 바와 같이, 꼬리의 길이를 하나의 손가락을 실행하는 것이다. (2)의 임상 점수는 완전히 마비 꼬리를 나타냅니다. 꼬리의 기지에서 마우스를 위로 따기 때 꼬리의 어떤 움직임이 전혀 발생하지 않는다. (3)의 임상 점수는 부분 뒷다리 마비를 나타냅니다. 이 점수의 결정은 마​​우스가 FLA에 자유롭게 이동할 수 있어야합니다t면. 하나 뒷다리 드래그하면 마우스가 전진으로, 또는 하나 또는 두 개의 뒷다리 일부가 마비 된 것으로 나타나면 (3)의 점을들 수있다. (4)의 임상 점수는 완전한 뒷다리 마비를 나타냅니다. 이 점수로, 마우스는 뒷다리를 이동 할 수 없습니다 및 전면 사지를 사용하여 자신을 앞으로 끌어 것입니다. (5)의 임상 점수는 죽어가는 마우스를, 또는 어려움 마우스는 케이지이나 호흡을 통해 자신을 이동. 마우스가 케이지의 하단 또는 호흡이 곤란하면 자체를 드래그 할 수없는 경우, 마우스는 인도적 안락사되어야한다. (6)의 임상 점수는 새장에서 죽은 마우스를 나타냅니다. 6의 점수는 특이하고 EAE 이외의 사망 원인을 조사해야한다.

비정형 임상 질환 수도 있고 마비를 동반 할 수 없습니다. 마우스는 전형적인 질병 플러스 전형적인 증상을 제시하는 경우는 두 개의 분리 된 채점 시스템을 포함 할 필요가있다. 0의 점수는 더 이상 행동하는 없다전형적인 채점 시스템들. 마우스는 산책하는 동안 하나의 임상 점수는 약간의 머리 회전 또는 기울기를 나타냅니다. 이것은 마우스가 앞으로 걸어 있도록 그 움직임에 일정한 좌우 방향성을 관찰함으로써 결정될 수있다. (2)의 임상 점수는 더 두드러 머리 회전과 가난한 복원력 능력을 나타냅니다. (1)의 전형적인 점수와 마찬가지로, 마우스의 움직임에 방향성을 가지고 있으며, 균형 약간의 어려움이있을 수 있습니다. (3)의 임상 점수는 직선으로 걷는 무능력을 나타냅니다. 마우스 어려움 균형을 가질 것이다하고 산책으로 오른쪽 자체 있도록 카의 측면을 사용할 수있다. (4)의 임상 점수로 인해 균형 문제로 걸을 수없는 옆에 누워 마우스를 나타냅니다. 마우스는 케이지의 하단에 자신을 드래그 할 수 있습니다 만, 그 움직임에 방향성을 가질 수있다. 지원하지 않는 5의 임상 점수는 연속 압연을 나타냅니다. 이 점수에 도달 마우스는 인도적 안락사되어야한다. 병원6의 알 점수는 새장에서 죽은 마우스를 나타냅니다. 6의 점수는 특이하고 EAE 이외의 사망 원인을 조사해야한다.

이 마우스의 상태 변화 약간 경우 또는 두 점수 사이에 선택하는 것이 어려운 경우 점수에 0.5을 추가, 예를 들어, 점수, "사이 -"를 허용 할 필요가있다. 예를 들어, 시작하는 마우스는 정상 대응보다 느리게 이동하지만 마비, 0.5의 점수를받을 수 있습니다 꼬리에 의해 획득시 그 다리를 플레잉하는 대신 앞과 뒷 발을​​ 걸쇠 마우스를 표시 없습니다 . 단지 케이지의 하단에 자신을 끌어 3.5의 점수를받을 수 있습니다 주기적으로 또는 때 감동의 뒷다리를 트 할 수 있습니다 마우스.

면역 세포의 침윤의 감소를 평가

C57BL / 6 마우스 모델에서의 EAE (도 1A, 0 일), 항원의 유도 후 presentati비장 T 세포의 증식에 발생할 일 1 - 약 3 ~ 5 일 임상 점수 본 초기 면역 세포 침윤 마우스 후 7 일 주위 CNS로 면역 세포 침윤 하였다 5. 치료제가 척수로 면역 세포 침투를 차단하고 있는지를 평가하기 위해, 약물 또는 비히클은 비장에서 항원 제시 및 증식 후 7 일째에 도입하지만, 면역 세포를 척수로 침투하기 전에된다. 면역 세포 침윤이 약화 된 경우 임상 적 질병 과정 일에서 질병의 상승 단계 10 ~ 15 (도 2) 동안의 개선 된 임상 점수를 반영해야한다.

면역 세포 침윤의 감소는 감소 된 신경 염증이 발생할 것이다. 반응성 astrocytosis 및 microgliosis는 신경 염증 주요 특징으로 간주됩니다. 이바-1 GFAP 및 미세 아교 세포와 성상 세포 염색을하는 것은 다음 장을 평가하는데 사용될 수있다평균 면적 분율 염색의 ES는 신경 염증 (그림 3)를 정량화한다.

면역 세포의 침윤이 감소되어 있는지 확인하기 위해 척수를 제거하고 질병의 피크 (그림 1A, 약 하루 18)에서 유동 세포 계측법 분석을 위해 처리됩니다. 이 면역 세포의 가장 큰 수는 척수을 체결했다고 보장합니다. 중추 신경계에 대한 T 세포의 입구 개시 염증성 이벤트 간주 모두와 Th17받은 Th1 세포가 EAE의 동물 모델뿐만 아니라 MS 환자에서 발견된다. 종합적 유세포 분석은 병원성 T 세포의 두 가지 유형의 평가를 포함한다. 또한, Tregs는 질병을 저해 잘 특성화 억제 T 세포이다. 따라서, 총 CD4 ^{+ 집단에서} Tregs의 비율은 이펙터 T 세포 개체군의 백분율과 비교하여 평가한다. 이 경우 THER T 세포 침윤의 전반적인 감소가 발생했는지 여부를 나타내거나 것E는 CNS에서 T 세포 표현형의 스큐이다. 대표 점 플롯 (도 4a) 비히클 - 처리 된 마우스 (오른쪽 사분면 번호)로부터 척수 비해 약물 처리 된 마우스에서 척수에서 T 세포 침윤 CD4 ^+의 전체 개수의 감소를 보여준다. 각각 IFN-γ ^+, IL-17 ⁺ 및 Foxp3의 ^+, 및 (그림 4A)을 감소해야합니다받은 Th1, Th17, 그리고 TREG 세포 다음 서명 단백질이 평가를 알아보고자 하였다. 통계 분석은 현저한 감소 (도 4b)를 보여주기 위해 CD4 ^+, IFN-γ ^+, IL-17 ⁺ 및 Foxp3의 ^{+ 세포} 수에 수행되어야한다. (및 Foxp3의 ⁺ 세포가 수행된다 ^-, IL-17 ⁺ IFN-γ ^- T 세포 하위 집합의 기울이기, IFN-γ ⁺ IL-17 ^+, IFN-γ ⁺ IL-17의 비율의 통계적 평가를 배제하려면 인터넷gure 4C).

T 세포 CNS가 침윤 감소가 주변부에서 증식,​​ 활성화 및 분화를 억제하는 결과이다 가능성을 제거하기 위해, 적극적으로 T 세포 아형의 비율에 부가하여 T 세포 증식의 개수가 평가 될 필요가있다. 활성화 및 분화는 영향을받지 (그림 5A) 경우 어떤 CD4 ^+, IFN-γ ^+의 비율의 변화, IL-17 ^+, 또는 Foxp3의 ^+를 찾을 ^수 없습니다해야합니다. 확산 (그림 5B) 영향을받지 않는 경우 또한, 사료된다 ⁺ CD4 ^{+ 세포의} 변화를 찾을 수 없습니다해야합니다. 약물 치료법은 7 일째에 도입 된 이후 주변에 초기 항원 제시 및 T 세포 활성화를 피하기 위해 변경. 그러나, 유전 적 모델 단백질은 종종 배아 동안 구조적으로 삭제 또는 비장 ASSE을 EAE의 유도 전 유도높은 중요성 ssment.

CNS 보호 평가

특정 치료제는 면역 세포의 침윤 후 CNS 질병의 병리를 변조하는 경우 설명하기 위해, 약물 개입은 임상 질병 득점의 첫 번째 피크 기간 동안 투여해야한다. 이 마우스는 재발 완화 성 표현형을 나타내는 때문에 EAE의 SJL 모델이 실험 유리하다. 약물 치료가 수초 - 축삭 변성을 방지하는 경우, 임상 점수 향상 (그림 6)를 관찰한다. 수초의 병리학 적 평가는 개선 된 임상 점수와 일치 수초 손상의 감소를 확증해야합니다. 정량적으로 수초의 무결성, 미엘린 염기성 단백질의 DAB 염색을 평가하기 위해 (MBP)이 염색의 광학 밀도의 통계 분석 (그림 7) 다음에 수행된다. 또한 그 신경 염증을 입증하기 위해 지속 또는 therape에 의해 감소utic 개입 반응성 신경교 증이 (도 3) 상술 한 바와 같이 반응성 신경교 증에 대한 평균 면적 비율을 측정함으로써 평가 될 수있다. 치료 개입이 직접 면역 효과없이 CNS를 보호하고 있음을 확증하기 위해, 비장에서 면역 세포의 중추 신경계에 침투와 확산의 감쇠 할인해야합니다. 이 문제를 해결하기 위해, 뇌 면역 세포 침윤 및 말초 T 세포의 증식 및 활성화의 평가 척수 평가 방법은 상기 한 바와 같이 수행되어야한다 (도 4 및도 5). 이와 함께, T 세포 나 주변의 T 세포 증식은 CNS 함침 감소의 증거로 CNS 세포 손상을 차단하는 치료제 CNS 보호 치료법이다.

그림 1. 대표 ResuC57BL / 6, SJL 마우스에 EAE에서 임상 점수의 LTS. (A) 임상 점수는 만성 질환으로 EAE를 생산하는 MOG _35-55로 유도 (N = 10) / 6 마우스 C57BL의 (± SEM을 의미). (B) 임상 점수는 재발 완화 성 EAE 병을 생산하는 PLP _139-151로 유도 SJL 마우스 (N = 3)의 (평균 ± SEM). (C) EAE 생쥐 일반적인 질병의 진행을 추적하는데 사용되는 임상 점수 섹션. (D) EAE 마우스의 전형적인 질병의 진행을 추적하는 데 사용되는 임상 채점 루 브릭. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

EAE와 C57BL / 6 마우스 그림 2. 약리 치료 이전에 면역에 세포의 침윤. C57BL / 6 마우스 MOG _35-55으로 7 일 postimmunization에서 PBS로 처리 (N = 20) 또는 SAS (N = 19)의 임상 점수 (± SEM을 의미). 데이터는 세 풀링 독립적 인 실험에서입니다. 통계적으로 유의 한 차이는, * P <0.05 비모수 양측 맨 - 휘트니 U 테스트를 사용하여 측정 하였다. (11)로부터 허가를 재 인쇄 할 수 있습니다.

그림 3. 면역 형광 염색 및 제어, EAE의 척수에서 반응성 신경교 증의 정량화 및 치료 C57BL / 6 마우스. (A) 제어의 척수에서 GFAP (성상 세포)와 이바-1 (미세 아교 세포)에 대한 형광 라벨 (면역화 PBS (중간 패널) 또는 SAS (오른쪽 패널)로 처리) 마우스 (왼쪽 패널)와 EAE 마우스. 스케일 바 = 100 μm의. 염색 정량 immunop 퍼센트를 측정 면적 분율 기법을 사용하여 측정 하였다GFAP (B)와 이바-1 (C)에 대한 ositive 영역입니다. , ± SEM을 의미 N = 3 컨트롤, N = 3 SAS가 처리 또는 n = 4 PBS 처리 된 마우스, 마우스 당 6 절. 통계적 차이는 일방 ANOVA를 사용하여 측정 하였다 * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001. 다시 인쇄 (11)의 허가와. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

EAE C57BL / 6 마우스 척수의 그림 4. 외과 분석. 처리 된 마우스에서 T 세포 침투를 감소 시연 C57BL / 6 마우스 EAE의 7 일 이내의 postinduction를 시작, SAS 또는 PBS로 처리 하였다. 척수가받은 Th1 (IFN-γ ⁺ / IL-17 ^-) 표시 일 (15) (A) 대표 도트 플롯에 얻었다과 Th17을 (IFN-γ^- / IL-17 ⁺⁾ CD4 ^{+ 게이트} (상단 패널)와 T 조절 세포 (Foxp3를 ⁺⁾ (하단 패널)에있는 세포. 도트 플롯은 오른쪽 상단 사분면의 비율을 보여줍니다. (B)의 절대 CD4 ⁺ 세포의 수뿐만 아니라, IFN-γ의 ^+, IL-17A ^{+와 +} Foxp3의 세포는 통계적으로 분석 하였다. (C) SAS- 및 PBS 처리 마우스 사이 EAE T 세포 개체군의 백분율에서의 변화도 관찰 하였다. 두 개의 독립적 인 실험에서 처리 SAS과 N = 9, ± SEM 평균, N = PBS 처리 10. 두 꼬리 t 테스트는 모든 막대 그래프에 사용되었다. ** P <0.01. 다시 인쇄 (11)의 허가와. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5. FACEAE C57BL / 6 마우스 비장의 S 분석 치료와 처리되지 않은 마우스에 상응하는 T 세포 발현 프로필 및 확산을 입증. PBS-및 SAS 처리 된 마우스의 비장은 EAE의 15 d 개 postinduction을 분석 하였다. (A) CD4 ⁺ T 세포의 백분율받은 Th1 (IFN-γ ⁺ / IL-17 ^-) Th17 (IFN-γ ^- / IL-17 ⁺⁾ PBS-로부터 비장, 그리고 T 조절 세포 (Foxp3의 ⁺⁾ 처리 (N = 10)를 2 개의 독립적 인 실험으로부터 (N = 9) 마우스 SAS는 처리. (B, 왼쪽 패널) 순 비장으로부터의 CD4 ^{+ 인구} 기-67 ⁺ 세포의 비율은 (N = 4)과의 PBS-(N = 5), SAS 처리 된 마우스 (N = 5)로 유도 EAE. 단방향 ANOVA 테스트는 PBS-또는 SAS 처리 EAE의 비장 중 하나에 비해 순진 비장에서 기-67 ⁺ 세포의 비율 사이의 통계적 유의성을 보여 주었다. 어떤 의미는 PBS-및 SAS 처리 EAE의 비장 사이에 관찰되지 않았다. (B, 오른쪽 패널) 대표 도트 플롯; 번호는 확산의 비율을 나타냅니다. 도트 플롯 비율을 보여줍니다. 막대 그래프는 두 개의 꼬리 t 테스트를 나타내고, *** p <0.001. 다시 인쇄 (11)의 허가와. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6. 약리 치료 후 EAE와 SJL 마우스에 면역 세포 침투. 임상 점수 (± SEM을 의미) PBS로 처리 SJL 마우스의 (N = 8) 또는 SAS (N = 8) PLP와 하루 24 postimmunization (점선)에서 _139-151. 데이터는 임상 점수의 ± SEM 평균입니다. 통계적으로 유의 한 차이는, *** p <0.001 비모수 양측 맨 - 휘트니 U 테스트를 사용하여 측정 하였다. 탑 라인은 통계에 사용되는 값을 나타냅니다분석. (11)로부터 허가를 재 인쇄 할 수 있습니다.

광학 밀도를 사용하여 MBP 염색 그림 7. 정량화. (A) EAE로 유도 한배의 새끼 제어 C57BL / 6 마우스에 비해 지정되지 않은 유전자 녹아웃 마우스에서 흉부 척수에 MBP의 대표 염색. 브라켓이 감소 MBP 염색 나타내는 탈수 초화의 대표 영역을 나타냅니다. 지정되지 않은 유전자 녹아웃 C57BL / 6 마우스에서 흉부 척수의 (B) MBP 염색. (C) EAE로 유도 지정되지 않은 유전자 녹아웃 마우스 (KO n은 = 6 마우스, 2-4 요추 및 동물 당 흉부 절) 야생형 (WT에 비해 척수에 MBP 염색의 높은 광학 밀도 (OD)를 전시, N = 3 마우스, 2-4 요추 및 EAE로 유도 흉부 동물 당 부분) 마우스. 통계적으로 분석 USI* P <0.05, 두 꼬리 t 테스트를 ng를. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 스케일 바 100 μm의.

토론

MS 환자는 CNS로 T 세포 활성화 및 / 또는 침투를 감쇠 약물 복용 직접 CNS 보호 치료법의 개발을 정당화하는 동안 질병의 재발을 경험하는 것을 계속한다. EAE는 고전 MS의 현상을 모델링하기 위해 사용되었고, 생체 내에서의 면역 시스템 및 CNS의 상호 작용의 특성을 연구 할 때 강력한 도구가 될 수있다. 주변부에서 면역 세포 상기 CNS의 침투 및 확산 및 활성화를 검사와 함께 전 또는 질병의 개시 후 치료 EAE의 고려, 예를 들어, 타이밍을 사용하여, 면역 체계 모두에서 치료 효과를 서술 할 수있다 중추 신경계.

C57BL / 6 마​​우스에 EAE이 널리 이용되고 있지만 이러한 마우스는 실질의 재발 송금 표현형 및 면역 세포의 침윤이 같이 SJL 마우스에 EAE는 MS의 대부분의 경우 더 많은 대표 될 수있다뇌 ^10. SJL 마우스는 질병이 제시 한 후에는 가능한 치료를 시작하고 있지만 감소 염증의 시간 동안,뿐만 아니라 사함을하는 동안 분명 복구가 있습니다. SJL 마우스는 항상 재발 및 결과를 풀링 할 때 잠재적으로 큰 변화의 결과로, 동시성에 송금하지 않도록 고려하는 것이 중요합니다. 따라서 일부 연구자들은 질병의 진행에 개별 지점에서 FACS 분석 및 조직학을 위해 마우스를 복용하는 동안 한 동물에서 임상 점수에 대한 대표적인 결과를 표시하도록 선택할 수 있습니다.

조작이 치료는 면역 시스템 또는 중추 신경계에 영향을 미치는 방법의 결정에 도움을 줄 수 EAE 마우스에 대한 때 고려. 처리가 시작되면 많은 옵션 자체의 면역 세포가 CNS에 진입했는지에 대한 내포 방법 각각은은 CNS와 상호 작용 될 수있다. 증상의 발병하기 전에 치료는 면역 세포가 아직 입력 또는 중추 신경계에 손상을 발생하지 않은 것을 의미한다.증상의 발병 후 치료는 면역 세포가 중추 신경계를 입력 한 일부 손상의 원인이 있다는 것을 의미한다. SJL 마우스를 사용, 치료는 면역 세포가 활발하게 침투 및 염증을 유발하거나 면역 세포가 적은 염증으로 CNS에 널리 보급 될 수 사함, 동안되는 재발 동안 시작할 수 있습니다. 면역 세포 치료시 병적 과정에서 어디 고려할 때 치료법은 CNS 및 면역계에 미치는 영향에 관한 초기 가정이 이루어질 수있다.

치료는 면역 세포 및 CNS, EAE 증상의 중증도를 감소시키는 최종 결과 각각 영향을 미칠 수있는 여러 가지 방법이있다. 그러므로, 면역 세포가 CNS 입력 여부 외주와 CNS에 영향을 받는지 면역 세포 보는 유세포 분석 및 면역 조직 화학 법을 사용하는 것이 필요하며, 중추 신경계 치료에 반응하는 방법. 척수의 유세포 분석은 얼마나 많은 셀 HA를 결정할 수 있지만주어진 시간에 CNS를 입력했습니다, 하나는 면역 세포의 증식이 비장에 영향을받지 않는 한이 효과가 감소 된 면역 세포 인신 매매에 의한 것을 확인할 수 없습니다. 이는 말초 및 CNS 조직을 분석하여 양쪽 조직을 비교할 때 기계적으로 의미하는 결과를 결정하는 것이 필요하다. 면역 세포 활성 프로파일이 조절 T 세포 무거운 프로필 병원성 헬퍼 T 세포 무거운 프로필 스위치를 갖는, 예를 들면, 처리에 의해 변경되는 것이 또한 가능하다. 다른 세포 유형의 마커를 찾고 치료 및 치료 동물 사이 %의 발현을 비교하는 따라서도 중요한 고려 사항이다. MS 연구 신흥 개념은 B 세포가자가 면역 탈수 초에서 중요한 역할을한다는 것을 암시한다. 이것은 B 세포는 T 세포 ^(20)의 활성화에 필요한 것을 보여주는 연구에 기초한다. 이 개념은 예 리툭시 맵, CD20의 예에 대한 항체와 같은 치료의 성공에 의해지지된다B 세포 ^{(21, 22)의} 표면에 가압. 임상 시험에 모노클로 날 항체 ocrelizumab의 성공에 의해 입증 된 바와 같이, CD20의 다른 에피토프를 표적 약물은 B 세포 치료제 타겟 ^(23)의 효과를 향상시킬 수있다.

여기에 제시된 기술의 한 가지 제한은 면역 세포가 CNS를 입력하지만 실질 여행 할 수 없게하는 것이 가능하다는 것이다. 면역 취급과 미처리 동물 사이에서 실질 이동 거리를 면역 세포의 혈관 주위있는 절삭을 검출하고 평가하기 위해 사용될 수있다. 또 다른 잠재적 인 한계가 EAE 병인의 마이크로 바이의 효과를 포함한다. 공생 장내 미생물은 크게 질병 발병 ^{(24)에 영향을} 미칠 ^수있다; 따라서, 마우스는 다른 식민지에 보관, 심지어 다른 우리에서 질환의 중증도에 광대 한 차이가있을 수 있습니다. 동일한 케이스에서 발생 한배 새끼 컨트롤을 사용 가능한 따라서, 항상 바람직EAE를 포함하는 실험. 마지막 주는 주변의 면역 세포 증식의 변화의 영향을 제거하기 위해 실험적으로 바람직한 경우, 패시브 전사 유도하기보다는,이 프로토콜에 기재된 활성 유도를 이용하여이를 수행 할 수있을 수 있다는 것이다.

신경에 대한 확인은 또한 세포 사멸 또는 선택적 세포 유형에 단백질의 결실을 허용 조건부 녹아웃 마우스의 사용을 통해 특정 메커니즘을 테스트하기 위해 공존 배양 시스템 ^(11)을 사용하여 달성 될 ^수있다. 또한, 신경 있습니다 약리 에이전트의 탐사를 확장, 축삭 절개 및 신경 세포의 죽음의 표식이 포함되어야한다. 중요성의 또 다른 영역은 재유 수화입니다. 부상 축삭은 신경 치료가 재유 수화 치료의 중요한 부분이되어야 추가 지원 대출 remyelinate 할 수 없습니다. 또한, 수초 축삭은 myelina보다 부상에 더 취약테드의 축삭. 이것은 축삭이 축삭 손상을 방지 할 적절한 재유 수화를 촉진 탈수 초 치료 적 개입이되면 제안합니다. 이 도로를 탐색하려면, 탈수 초화 및 재유 수화 다른 생체 내 모델 (즉, cuprizone 및 리소 레시틴)을 사용할 수있다. 이 방법은 본원에서 미엘린 손실을 정량함으로써 신경 평가에 초점을 설명한다. 재유 수화 평가 선조 세포의 수뿐만 아니라, 증식과 같은 조사하는 것이 중요 할 것이다 성숙 그들의 능력. 이러한 대안 모델의 언급으로, 사람은 급속도로 매개되는 뇌염의 다른 모델을 고려해야합니다. 미엘린 손실을 생성 두 잘 특성화 RNA 바이러스 모델이있다 : 하나는 Theiler의 쥐 뇌척수염 비 포위 Picornaviridae 바이러스이고, 다른 하나는 마우스 간염 바이러스의 Coronaviridae 바이러스 군 ^{(25, 26)의} 일원이다.

EAE는 일을위한 유용한 도구입니다조작 또는 치료가 면역 체계와 생체 내에서 중추 신경계에 영향을 미치는 방법의 udies. 치료는 질병 과정에 영향을 미치는 곳은 혈액 - 뇌 장벽에서 또는 CNS에서 주위에 있는지 여부를 결정하는 데 도움 여기에 설명 된 프로토콜. MS에 대한 현재의 치료는 질환 및 환자의 시간에 종종 경험 하락을 치료하지 않습니다. 마찬가지로, 급성 파종 성 뇌척수염, 횡단 성 척수염 및 시신경 척수염,이 면역 세포에 침투하여 공격 바로 아래로 CNS를 보호 부족​​ 치료를 포함하는 면역 세포의 중추 신경계에 침투와 수초의 분해를 포함하는 다른 질병. 고려 처리의 타이밍을 촬영 및 치료에 대하여 이루어져야 기계적 결정을 허용한다 염증 손상을 평가하기 위해 CNS의 면역과 관련하여 유세포 분석 비장 및 척수를 사용.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 x 22 x 20 mm embedding mold	Fisher Scientific	NC9719245
22 x 30 x 20 mm embedding mold	Fisher Scientific	NC9531194
2-Mercaptoethanol (55 mM)	Thermo Fisher Scientific	21985-023
2-Methylbutane	Fisher Scientific	O3551-4
30 x 22 x 20 mm embedding mold	Fisher Scientific	18-30
ACK Lysing Buffer	Quality Biological	118-156-101
anti-CD4 PE-Cy7	BD Biosciences	552775	0.2 mg/ml stock concentration
anti-Foxp3-FITC	eBioscience	11-5773-82	0.5 mg/ml stock concentration
anti-GFAP (Cocktail)	Biolegend	835301	1 - 3 mg/ml stock concentration
anti-Iba-1 Polyclonal Antibody (50 µg)	Wako	019-19741	0.5 mg/ml stock concentration
anti-IFN-γ APC	eBioscience	17-7311-82	0.2 mg/ml stock concentration
anti-IL-17A PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-7177-82	0.2 mg/ml stock concentration
anti-Ki-67 PE	eBioscience	12-5698-82	0.2 mg/ml stock concentration
anti-MBP (D-18)	Santa Cruz Biotechnology	sc-13912	0.2 mg/ml stock concentration
anti-TCRβ FITC	eBioscience	11-5961-85	0.5 mg/ml stock concentration
anti-TCRβ PE	eBioscience	12-5961-83	0.2 mg/ml stock concentration
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG	Vector Labs	BA-1000	1.5 mg/ml stock concentration
Biotinylated Horse Anti-Mouse IgG	Vector Labs	BA-2000	1.5 mg/ml stock concentration
Citric Acid, Anhydrous, 99.5%	Fisher Scientific	AC42356-5000
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), tetrasodium salt dihydrate, 99%	Fisher Scientific	AC446085000
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30071.03
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, case of 10	Fisher Scientific	12-550-15
Golgi Plug	BD Biosciences	555029	protein transport inhibitor
Immedge Hydrophobic Barrier Pen	Fisher Scientific	NC9545623
Ionomycin	EMD Millipore	407952-5mg
L-Glutamine, 100x	Corning	25-005-Cl
MEM Nonessential Amino Acids	Corning	25-025-Cl
Near IR Live/Dead Staining Kit	Life Technologies	L10119	viability dye
Normal goat serum	Vector Labs	S-1000
Normal horse serum	Vector Labs	S-2000
Paraformaldehyde, 96%	Fisher Scientific	AC416785000
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-Cl
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	density gradient
Permount	Fisher Scientific	SP15-500	resinous mounting medium
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma	P1585-1mg
Purified anti-Myelin Basic Protein Antibody	BioLegend	808401
RPMI 1640	Corning	10-040-CM
Sodium Pyruvate	Corning	25-000-Cl
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	nonionic detergent
Vectastain Elite ABC Kit (Standard)	Fisher Scientific	NC9206402	avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase
Vector Laboratories Peroxidase Substrate Kit (DAB)	Fisher Scientific	NC9276270	DAB solution