다음을위한 고성능 컴팩트 광 음향 단층 촬영 시스템<em&gt; In Vivo</em&gt; 소형 동물 뇌 영상

요약

소형 동물에서의 고속 생체 내 뇌 이미징을위한 소형 펄스 레이저 다이오드 기반 광 음향 단층 촬영 (PLD-PAT) 시스템이 시연되었습니다.

초록

생체 내 작은 동물 영상은 전임상 연구에서 중요한 역할을합니다. Photoacoustic tomography (PAT)는 전임상 및 임상 적용 모두에 대한 큰 잠재력을 보여주는 신흥 하이브리드 이미징 양식입니다. 기존의 광 매개 오실레이터 기반 PAT (OPO-PAT) 시스템은 부피가 크고 값 비싸고 고속 이미징을 제공 할 수 없습니다. 최근 펄스 레이저 다이오드 (PLD)가 PAT의 대안적인 여기 소스로서 성공적으로 시연되었습니다. 펄스 레이저 다이오드 PAT (PLD-PAT)는 광 음향 팬텀 및 생물 조직에서의 고속 이미징에 성공적으로 시연되었습니다. 이 작품은 PLD - 팻을 사용하여 생체 내 뇌 이미징을위한 시각화 실험 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에는 소형 PLD-PAT 시스템 구성과 그 기술, 뇌 이미징을위한 동물 준비 및 2D 횡단면 쥐 뇌 영상을위한 전형적인 실험 절차가 포함됩니다. PLD-PAT 시스템은 콤팩트하고 비용은 저렴합니다.fective이며 고속, 고품질 이미지를 제공 할 수 있습니다. 생체 내 에서 다양한 스캔 속도로 수집 된 뇌 이미지가 제시됩니다.

서문

Photoacoustic tomography (PAT)는 임상 및 전임상 연구 ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} 에서 많은 응용 분야가있는 하이브리드 이미징 모달입니다. PAT에서 나노초 레이저 펄스는 생물학적 조직을 조사합니다. 조직 발색단에 의한 입사광의 흡수는 국부적 인 온도 상승을 일으키고, 이는 음파의 형태로 방출되는 압력 파를 산출합니다. 초음파 검출기는 샘플 주변의 다양한 위치에서 광 음향 신호를 수집합니다. 광 음향 (PA) 신호는 광섬유 이미지를 생성하기 위해 다양한 알고리즘 (예 : 지연 - 합 알고리즘) ⁶ 을 사용하여 재구성됩니다.

이 하이브리드 이미징 모달리티는 고해상도, 심 조직 이미징 및 높은 광학 흡수 대비를 제공합니다 ^.class = "xref"> 8. 최근에는 더 긴 파장 (~ 1,064 nm)과 인산염 프탈로시아닌 (phosphorus phthalocyanine)이라는 외인성 조영제를 사용하여 닭 가슴 조직에서 ~ 12 cm 이미징 깊이 ⁹ 가 달성되었습니다. 이 깊이 감도는 공 촛점 형광 현미경, 2 광자 형광 현미경, ¹⁰ 광 결맞음 단층 촬영 등과 같은 다른 광학 방법의 깊이 감도보다 훨씬 높습니다 . 하나 이상의 파장을 사용하여 PAT는 장기의 구조적 및 기능적 변화를 나타낼 수 있습니다 . 많은 인간의 질병에 대해, 작은 동물 모델은 잘 확립되어 있습니다 ^{12 , 13 , 14 , 15} . 작은 동물의 이미징을 위해 몇 가지 양상이 입증되었습니다. 이러한 모든 접근법 중 PA 이미징은 앞서 언급 한 장점으로 인해 빠르게 주목을 받았습니다. 아빠T는 작은 동물 ^{4 , 16 , 17 , 18} 의 조직과 기관 ( 즉, 심장, 폐, 간, 눈, 비장, 뇌, 피부, 척수, 신장 등 )에서 혈관을 영상화 할 수있는 가능성을 보여주었습니다. PAT는 소 동물 뇌 영상을위한 잘 확립 된 양식입니다. PA 파는 발색단에 의한 광 흡수로 인해 생성되므로 다중 파장 PAT는 총 헤모글로빈 농도 (HbT)와 산소 포화도 (SO ₂ ) ^{19 , 20 , 21 , 22} 의 매핑을 허용합니다. 뇌의 신경 혈관 이미징은 외인성 조영제 ^{12 , 23 , 24} 의 도움으로 이루어졌습니다. PA 양식은 뇌 건강에 대한 더 나은 이해를 돕습니다.분자 및 유전 수준에서 정보를 제공합니다.

작은 동물 이미징의 경우, Nd : YAG / OPO 레이저가 PAT 여기 소스로 널리 사용됩니다. 이 레이저는 ~ 10-Hz 반복 속도로 약 5 ns의 근적외선 펄스 (에너지가 OPO 출력 창에서 ~ 100 mJ)를 전달합니다. 이러한 레이저가 장착 된 PA 시스템은 값이 비싸고 부피가 크며 레이저 소스의 반복률이 낮기 때문에 단일 요소 초음파 변환기 (UST)로 저속 이미징이 가능합니다. 이러한 PA 시스템의 일반적인 A- 라인 획득 시간은 단면 ²⁵ 당 ~ 5 분입니다. 그러한 긴 측정 시간을 가진 영상 시스템은 전신 영상, 시간 - 해상도 기능 영상 등 을위한 생리적 매개 변수를 제어하기가 어렵 기 때문에 작은 동물 영상에 이상적이지 않습니다 . 다중 단일 소자 UST를 채택함으로써, 어레이 기반의 UST 또는 높은 반복 속도의 레이저를 사용하면 PA의 이미징 속도를 높일 수 있습니다시스템. 샘플 주위의 모든 PA 신호를 수집하기 위해 하나의 단일 요소 UST 만 사용하면 시스템의 이미징 속도가 제한됩니다. 고속 또는 고감도의 이미징 기술을 위해 원형 또는 반원형 형상으로 배열 된 여러 개의 단일 요소 UST가 시연됩니다. 선형, 반원형, 원형 ​​및 부피 측정 어레이와 같은 어레이 기반 UST ²⁶ 이 실시간 이미징에 성공적으로 사용되었습니다 ¹ . 이러한 어레이 기반 UST는 이미징 속도를 높이고 측정 감도를 낮추지 만 비싸다. 그러나 어레이 기반 UST를 사용하는 PA 시스템의 이미징 속도는 여전히 레이저의 반복 속도에 의해 제한됩니다.

펄스 레이저 기술은 높은 반복 속도의 펄스 레이저 다이오드 (PLD)를 만들기 위해 발전했습니다. 7,000 frames / s 임상용 초음파 플랫폼을 사용하는 PLD로 B- 스캔 광 음향 이미징이 시연되었습니다. 이러한 PLD는 th의 영상 속도를 향상시킬 수있다.e PAT 시스템, 심지어 단일 요소 UST 순환 스캐닝 형상. 단일 요소 UST는 어레이 기반 UST와 달리 저렴하고 민감합니다. 지난 10 년 동안, PA 영상의 자극 원으로서 고 반복률 PLD의 사용에 관한 연구는 거의보고되지 않았다. 섬유 기반의 근적외선 PLD가 팬텀 ^28의 PA 이미징에 대해 입증되었습니다. 인간의 피부 아래 ~ 1mm 깊이에서 혈관을 생체 내 이미징 한 것은 저에너지 PLD ^29를 사용하여 입증되었습니다. PLD 기반의 광학 해상도 photoacoustic microscope (ORPAM)이보고되었습니다. PLD를 사용하여 0.43 Hz의 프레임 속도에서 ~ 1.5 cm 깊이 이미징이 입증되었습니다 ³⁰ . 아주 최근에, PLD-PAT 시스템은 생물학적 조직에서 약 3 초 및 약 2 cm 이미징 깊이에서 이미지를 제공하는 것으로보고되었다. 이 연구는 그러한 저가의 소형 시스템이 높은 쿼아를 제공 할 수 있음을 입증했다.lity 이미지, 고속에서도. PLD-PAT 시스템은 높은 프레임 속도 (7,000fps) 광 음향 이미징, 표면 혈관 이미징, 손가락 관절 영상, 2cm 깊이 조직 이미징, 소형 동물 뇌 영상 등을 위해 사용될 수 있습니다 . 단일 파장 및 PLD로부터의 낮은 펄스 에너지 펄스는 멀티 스펙트럼 및 심 조직 이미징으로의 적용을 제한합니다. 실험은 전임상 적용에 사용 된 것과 동일한 PLD-PAT 시스템을 사용하여 작은 동물에 대해 수행되었습니다. 이 연구의 목적은 작은 동물의 생체 내 2D 횡단 뇌 이미징을위한 PLD-PAT 시스템의 시각화 된 실험 데모를 제공하는 것입니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 싱가포르 남양 기술 대학교 (Animal Protocol Number ARF-SBS / NIE-A0263)의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을받은 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다.

1. 시스템 설명

1. 그림 1a 와 같이 원형 스캐너 안에 PLD를 장착하십시오. PLD를 레이저 드라이버 장치 (LDU)에 연결하십시오.
   참고 : PLD는 최대 펄스 에너지가 ~ 1.42 mJ이고 반복 속도가 최대 7 kHz 인 ~ 803 nm의 파장에서 ~ 136 ns 펄스를 제공합니다. 레이저 구동 유닛 (LDU)은 온도 제어기, 가변 전원, 전원 (12V) 및 함수 발생기를 포함한다. 재료 표를 참조하십시오. 가변 파워 서플라이는 레이저 파워를 제어하는데 사용되며, 함수 발생기는 PLD의 반복률을 변경하는 데 사용됩니다.
2. PLD 레이저를 켭니다. PLD 반복률을 "7,000"으로 설정합니다. Hz를 LDU의 함수 발생기를 사용하여 계산합니다. 가변 전원 장치의 전압을 "3.1"V로 설정하여 펄스 에너지를 1.42mJ로 증가시킵니다.
3. 그림 1a 와 같이 광 확산기 (OD)를 PLD 출구 창 앞에 설치하여 출력 빔을 균일하게 만듭니다.
   참고 : 미세 입자 ( 예 : 1,500- 그릿 광택)가있는 디퓨저를 사용하십시오.
4. UST 홀더에 초점을 맞춘 UST를 그림 1a 와 같이 스캐닝 영역의 중심을 향하도록 장착합니다.
   참고 : UST의 중심 주파수는 2.25MHz이고 초점 길이는 1.9 인치입니다.
5. 그림 1a 와 같이 초음파 감지기를 아크릴 탱크 안에 놓습니다 . UST가 완전히 잠기도록 탱크를 물로 채 웁니다.
   참고 : 수중 매체는 뇌 (샘플)의 광 음향 신호를 UST에 연결하는 데 사용됩니다. 아크릴 물 탱크 (WT, 재료 표 참조)는 맞춤형입니다작은 동물 이미징을 위해 설계되었습니다. 물 탱크 설계도는 그림 1b에 나와 있습니다.
6. 펄서 / 리시버 장치 (PRU; 재료 표 참조)를 사용하여 샘플에서 PA 신호를 확인하십시오.
   참고 :이 신호는 100MS / s 샘플링 속도로 12 비트 DAQ 카드 ( 재료 표 참조)로 디지털화되어 컴퓨터에 저장되었습니다.

2. 쥐 뇌 이미징을위한 동물 준비

참고 : 위에서 설명한 PLD - PAT 시스템은 작은 동물의 두뇌 이미징을 위해 시연되었습니다. 이 실험을 위해 건강한 암컷 쥐들 ( Table of Materials 참조)이 사용되었습니다.

1. 동물에게 케타민 2 mL, 자일 라진 1 mL 및 식염수 1 mL (0.2 mL / 100 g 용량)의 칵테일을 복강 내 주사하여 마취시킨다.
2. 머리 깎기를 사용하여 동물의 두피에있는 모피를 제거하십시오. 면도 크림에 부드럽게 제모 크림을 바릅니다.모피의 더 고갈을위한 영역.
   1. 면봉을 사용하여 4-5 분 후에 적용된 크림을 제거하십시오.
   2. 마취 및 레이저 조명으로 인한 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 인공 눈물 연고를 바르십시오.
3. 실습용 잭에 호흡 마스크 ( Table of Materials 참조)가 장착 된 주문 제작 동물 홀더 ( 재료 표 참조)를 장착하십시오.
4. 동물을 놓기 쉬운 위치에 놓습니다. 이미징 중 동물의 움직임을 피하기 위해 외과 용 테이프를 사용하여 홀더에 고정시킵니다.
5. 호흡 마스크가 쥐의 코와 입을 덮어 흡입 마취를 전달하는지 확인하십시오.

3. 생쥐 생쥐 뇌 이미징

1. 호흡 마스크를 마취 기계에 연결하십시오. 마취 기계를 켜고 0.75 % 이소 플루 란으로 산소 1.0 L / min을 전달하도록 설정하십시오.
   1. 맥박 산소 농도계를 클램핑하십시오.동물의 생리적 상태를 모니터하기 위해 꼬리를 잡아 당긴다.
2. 쥐의 두피에 무색의 초음파 젤 층을 바르십시오. 랩 - 잭 위치를 스캐너 중앙으로 조정하십시오. 호흡 마스크는 이미징 창에 맞게 사용자 정의됩니다. 시중에서 구할 수있는 코 콘 10 %를 자르고 장갑 조각에 연결하십시오.
   1. 이미징 비행기가 UST의 초점에 있도록 실험실 잭의 높이를 수동으로 조정하십시오.
3. 필요에 따라 데이터 수집 소프트웨어의 매개 변수를 설정하십시오 (재료 표 참조). 데이터 수집 소프트웨어 프로그램을 실행하여 수집 ( 즉, 이미징)을 시작하십시오.
   참고 :이 프로그램은 UST를 회전하고 A 라인 PA 신호를 수집하는 데 사용됩니다. 수집 된 A- 라인은 컴퓨터에 저장됩니다.
4. 전체 이미징 기간 동안 동물을 관찰하고 이미징이 완료된 후 PAT 재건을 진행하십시오.
5. 데이터 수집이 끝나면,재구성 소프트웨어 프로그램을 사용하여 A- 라인에서 횡단면 뇌 영상을 재구성하십시오.
6. 마취 시스템을 끄고 동물을 무대에서 꺼내서 새장으로 돌려 놓고 의식을 회복 할 때까지 모니터하십시오.
   참고 : 예를 들어, UST가 5 초 동안 회전하면 PLD는 35,000 (= 5 x 7,000) 펄스를 제공하고 UST는 35,000 개의 A 라인을 수집합니다. 35,000 개의 A 라인은 평균 70 개 이상의 신호를 평균화하여 (평균 A 라인 = 35,000 / 70 = 500) 평균 500 개로 축소됩니다. 그림 1c 는 레이저 펄스 및 A 라인 수집의 조명을 보여줍니다. 지연 - 합 역 투영 알고리즘을 기반으로 한 재구성 프로그램을 사용해야합니다.

그림 1 : PLD-PAT 시스템의 회로도 ( a ) PLD-PAT의 개략도. PLD : 펄스 레이저 다이오드, CSP : circuAM : 마취기, M : 모터, MPU : 모터 풀리 장치, LDU : 레이저 드라이버 장치, PRU : 펄서 / 리시버 장치, UST : 초음파 변환기, WT : 물 탱크, PF : 고분자 필름 및 DAQ : 데이터 수집 카드. ( b ) 생체 내 소 동물 뇌 영상을위한 수조의 평면도, 평면도 (1) ​​및 단면도 (2). A : 미터 나사, B : 아크릴 환형 판, C : 실리콘 "O"링, D : 100 μm 두께, 투명 폴리에틸렌 커버. 탱크는 바닥에 직경 9 cm의 구멍이 있었고, 초음파 및 광학적으로 투명한 100 μm 두께의 폴리에틸렌 막으로 봉인되었습니다. ( c ) PLD 및 A- 라인으로부터의 레이저 펄스의 조명의 도식. 5 초 연속 스캔 시간. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

이 섹션에서는 설명 된 PLD-PAT 시스템의 기능을 보여주는 생체 내 뇌 영상 결과를 보여줍니다. PLD-PAT 시스템의 고속 이미징 기능을 입증하기 위해 두 가지 건강한 쥐의 생체 내 뇌 영상을 수행했습니다. 그림 2 는 다양한 스캔 속도에서 암컷 쥐 (93g)의 뇌 이미지를 보여줍니다. 그림 2a 와 b는 두뇌 영역에서 두피를 제...

토론

이 작품은 쥐 PLD - PAT 시스템을 사용하여 생체 내 뇌 영상을 수행하기위한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에는 쥐의 뇌 영상에 대한 일러스트레이션뿐만 아니라 이미징 시스템과 그 정렬에 대한 자세한 설명이 포함되어 있습니다. 기존의 OPO 기반 PAT 시스템은 값 비싸고 부피가 크며 5-10 분 내에 하나의 단면 이미지를 제공 할 수 있습니다. PLD-PAT 시스템은 콤팩트하고 휴대 가능하며 저?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pulsed laser diode	Quantel, France	QD-Q1910-SA-TEC	It is the excitation laser source with specifications 803 nm, 1.4mJ per pulse, 136 ns pulse, 7kHz maximum, dimentions : 11.0 x 6.0 x 3.6 cm, weight: ~150 gm
Stepper motor with gearbox	LIN Engineering (Servo Dynamics)	Motor: CO-5718-01P, Gearbox: DPL64/1, I = 10 for NEMA 23; power supply PW100-48	To move the detector holder in a circular geometry. Torque: 2.08 N-m, Rotor inertia: 2.6 kg-cm2
Ultrasonic pulser/receiver	Olympus	5072PR	To receive, filter and ampligy the PA signal from UST. Its bandwidth is 35MHz, and gain is ±59 dB.
Ultrasound Transducer	Olympus	V306-SU-NK-CF1.9IN/Q4200069	Ultrasonic sensors used for photoacoustic detection. Central freqency 2.25 MHz, 0.5 in, Cylindrical focus 1.9 inch
PCIe DAQ (Data acquisition) Card	GaGe	CSE4227/ A6000610/B0E00610	12 bit, 100 Ms/s, 2 channels, 1 Gs on board memory, PCIe x16 interface
Rats	In Vivos Pte Ltd, Singapore	NTac:SD, Sprague Dawley / SD	Female, weight 100±10g
Acrylic water tank	NTU workshop	Custom-made	It contains the water that acts as an acoustic coupling medium between brain and detector
Circular Scanner	NTU workshop	Custom-made	Scanner is made out of Alluminum
Anesthetic Machine	medical plus pte ltd	Non-Rebreathing Anaesthesia machine with oxygen concentrator.	Supplies oxygen and isoflurane to animal
Pulse Oxymeter portable	Medtronic	PM10N with veterinary sensor	Monitors the pulse oxymetry of the animal
Ultrasound gel	Progress/parker acquasonic gel	PA-GEL-CLEA-5000	Clear ultrasound gel
Data acqusison software	National Instruments Corporation,Austin,TX,USA)	NI LabVIEW 2015 SP1	LabVIEW based program was developed in our laboratory for controlling the stepper motor and acquring the PA singnals from the detector
Data processing software	Matlab (Mathworks, Natick, MA, USA)	Matlab R2012b	Matlab code for reconstruction of PA images was developed in our lab
Temperature controller	LaridTech, MO,USA	MTTC1410	It will constantly control temperature of the PLD
12 V power supply	Voltcraft	PPS-11810	To supply operating voltage for PLD
Variable power supply	BASETech	BT-153	To change the laser output power
Funtion generator	Funktionsgenerator	FG250D	To change the repetetion rate of the PLD. It will provide TTL signal to synchronize the DAQ with the laser excitation.
Animal distributor	In Vivos Pte Ltd, Singapore		Animal distributor that supplies small animals for research purpose.
Animal holder	NTU workshop	Custom-made	Used for holding the animal on its abdomen
Breathing mask	NTU workshop	Custom-made	Used along with animal holder to supply anesthesia mixture to the animal
Pentobarbital sodium	Valabarb		Used for euthanizing the animal after the expeirment.
Optical diffuser	Thorlabs	DG10-1500	Used to to make the laser beam homogeneous