조각 패치 클램프 기술 학습 유도 소성을 분석 하기 위한

요약

조각 패치 클램프 기술 기본 속성 및 흥분 성의 또는 억제 시 냅 스의가 소성 학습 유도 된 변화를 분석 하기 위한 효과적인 방법입니다.

초록

조각 패치 클램프 기술 조사 특정 두뇌 지역에서 신경가 소성 학습 유도 위한 강력한 도구입니다. 모터-학습 유도 소성을 분석, 우리가 쥐 가속된 회전자 로드 작업을 사용 하 여 훈련. 쥐 1 개 또는 2 일에 대 한 10 번에서 30 s 간격으로 작업을 수행. 성능 첫 시험에 비해 훈련 일에 크게 개선 되었다. 우리는 다음 일반인 및 훈련 된 쥐에 기본 모터 피 질 (M1)의 급성 뇌 조각을 준비. 전류 클램프 분석 레이어 II/III 피라미드 뉴런에 막 잠재력, 스파이크 임계값, afterhyperpolarization, 고 막 저항 휴식에서 동적인 변화를 보였다. 현재 분사 유도 일반인된 컨트롤에 보다 2 일 훈련 된 쥐에 있는 많은 더 많은 스파이크.

상황별 학습 유도 소성을 분석, 우리가 쥐 금지 회피 (IA) 작업을 사용 하 여 훈련. 상자의 어두운 면에 발 충격을 경험한 후 쥐가 그것을 피하기 위해, 조명된 쪽에서 배웠습니다. 우리는 일반인, IA 훈련, 짝이 없는, 급성 hippocampal 슬라이스 및 실습 쥐 준비. 전압 클램프 분석 미니어처 흥분 성의 및 금지 postsynaptic 전류 (mEPSCs 및 mIPSCs) 동일한 CA1 신경에서 순차적으로 기록 하는 데 사용 되었다. 우리는 각 신경의 흥분 성의 억제 시 냅 스에서 다른 postsynaptic 강점 했다 제안 각 CA1 신경에서 다른 말은 mEPSC 및 mIPSC 진폭을 발견. 또한, IA 훈련 쥐 높은 mEPSC 및 mIPSC 진폭, 광범위 한 다양성을 했다 일반인 컨트롤과 비교. 이 결과 제안 상황별 학습 각 CA1 신경에서 흥분 성의 억제 시 냅 스에 postsynaptic 다양성을 만듭니다.

AMPA 또는 GABA_A 수용 체 postsynaptic 전류 CNQX 목욕 치료 이후 중재 하 듯 또는 bicuculline 각각 mEPSC 또는 mIPSC 이벤트를 차단 합니다. 이 기술은 공부 감각 피 질, 편도 등의 다른 지역에서 배우기의 다른 종류를 사용할 수 있습니다.

서문

정치학자 그리고 Sakmann에 의해 개발 된 패치 클램프 기술 electrophysiological 실험¹에 대 한 널리 사용 되었습니다. 전체 셀 패치 클램프 기술² 전류 세포내 또는 세포 막의 gigaohm 물개를 사용 하 여 전압을 기록 하는 데 사용할 수 있습니다. 전류 클램프 기술 잠재력, 저항 및 커패시턴스³휴식 같은 막 속성에 차이 분석할 수 있습니다. 전압 클램프 기술 흥분 성의 억제 시 냅 스에서 시 냅 스가 소성 학습 유도 분석할 수 있습니다.

기본 모터 피 질 (M1)은 숙련 된 자발적인 움직임을 만들기 위한 중요 한 중앙 지역 이다. 이전 electrophysiological 연구 시연 장기 potentiation (LTP)의 개발-같은 레이어 II/III 흥분 성의 synapses 숙련 된 모터 훈련⁴후에 소성. 또한, vivo에서 이미징 연구에 더 숙련 된 도달 작업^5,6후 M1 모 수석 등뼈의 개장 시연. 그러나, 학습 유도 시 냅 스 하 고 본질적인 소성 되지 M1 뉴런에 표시 되었습니다.

우리는 최근로 터 로드 작업 승진 glutamatergic 동적 변화 및 GABAergic synapses 고 M1 층 II/III 신경⁷에 본질적인 소성 변경 했다. 여기 우리 학습 유도 소성 조사 조각 패치 클램프 기술 사용. 이 기술은 또한 다른 두뇌 지구에서 경험 종속 소성의 다른 종류를 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다. 예를 들어 총 신 피 질에 감각 입력 AMPA 수용 체-중재 흥분 성의 입력을 레이어 II/III 신경⁸, 강화 수 있습니다 하 고 문장을된 두려움 컨디셔닝 강화 측면 편도 뉴런에 흥분 성의 입력이 필요 메모리⁹공포. 또한, 상황별 학습 hippocampal CA1 신경^10,11에 흥분 성의 억제 시 냅 스 입력 측면에서 다양성을 만듭니다.

프로토콜

모든 동물 주택 외 과적 동물 실험의 야마구치 대학의과 대학에 대 한 지침에 따라 했다와 기관 동물 관리 및 사용 시 위원회에 의해 승인 되었다 대학.

1. 동물

1. 4에 5-주-오래 된 남성 Sprague-Dawley 쥐 (나이의 출생 후 28 ~ 31 일)를 사용 하 여.
2. 12 h 명암 주기에서 일정 한 온도 (23 ° C ± 1 ° C)에서 유지 개별 플라스틱 케이지 (40 ㎝ × 25 ㎝ × 25 ㎝)에 쥐를 집. 게 쥐 광고 libitum 액세스 물과 음식.

2. 로 터 로드 테스트

모터 기술 학습, 회전자 막대 시험에 각 쥐 주제 조사
1. (막대 직경 7 cm, 차선 폭 8.9 cm;가 높이 26.7 cm) 1 개 또는 2 일 연속 ( 그림 1A 2016 국방 외에 < sup 클래스 = "외부 참조" > 7). 조용 하 고, 온도 제어 룸 (23 ± 1 ° C)에서 작업을 수행 합니다. 방해 하지 않거나 처리는 테스트 전에 쥐
2. 4 회전/분 5 분에 40 회전/min (8 π/분 80 π/min)에서 선형으로 증가 하는 가속 모드로 회전자 막대 설정
3. 휴식 회전 막대에 쥐를 넣어. 막대에 모든 사지 되는지 확인.
4. 모터 성능을 평가 하기 위해 회전 막대에서가을 대기 시간을 측정.
5. 허용 각 쥐 30의 간격으로 10 시도 (재판).
6. 쥐 회전 막대에서 떨어지면, 설정 막대에 10-20의 간격 후 다시.
7. 최종 재판 후 30 분 pentobarbital (400 mg/kg)의 과다와 쥐 희생. 자신의 집 새 마 취의 동일한 복용량 일반인된 제어 쥐를 주입.

3. 금지 회피 시험

1. 조사 상황별 학습 주제 쥐 금지 회피 (IA) 테스트 ( 그림 1D에 Mitsushima 그 외 여러분, 2011, 2013 ^{10 , 11}) 피와 같은 실험의 날에 어떤 에피소드 경험 사람들과, 케이지 변경 또는 청소 문의. 조용 하 고, 온도 제어 룸 (23 ± 1 ° C)에서 작업을 수행.
   참고: IA 교육 기구는 2 연 발 아크릴 상자 (길이 33cm, 폭 58cm, 높이 33 cm). 그것은 조명 안전 측면과 트랩 도어 ( 그림 1D)으로 구분 된 어두운 충격 측.
2. 조명된 상자의 안전 (조명된) 사이드에 쥐를 배치합니다. 스트레스 없이 부드럽게 쥐 처리.
3. 대기 짧은 시간 (10 ~ 20 s) 환경에 쥐를 적응.
4. 자유로이 어두운 상자 입력 쥐 수 있도록 슬라이딩 도어를 엽니다.
5. 쥐 소설 어둠 상자를 입력 하기 전에 대기 시간 (s)를 측정 합니다. 첫 번째 재판의 대기 시간을 나타냅니다는 쥐 ' 훈련 전에 s 성능.
6. 어둠으로 입장, 후 문을 닫고 스크램블된 전기 발 충격을 적용 (2 s, 1.6 mA) 설정 상자의 바닥에 전기 강철 막대를 통해. 실습 쥐 충격된 되지 않고 1 분 동안 훈련 장치를 탐험 하실 수 있습니다. 대 한 몇 가지 조명된 충격 장에 집 짝이 없는 쥐 일 갑자기 줄 에피소드 경험 없이 충격. 어떤 그룹에서 스트레스 없이 부드럽게 처리.
7. 10 어둠 상자에 각 쥐를 계속 집 케이지를 반환 하기 전에 s.
8. 에서 30 분 발 충격 후 다시 조명 상자에 쥐를 놓습니다. 어두운 면을 입력 대기 시간 측정.
9. 홈 케이지를 쥐 반환.
10. 에서 60 분, 충격 후 pentobarbital (400 mg/kg)의 과다로 쥐를 희생. 쥐를 부드럽게 처리 하 고 intraperitoneally 마 취 주사. 훈련 되지 않는 통제 쥐에 있는 위에서 설명한 경험 없이 자신의 집 새에 마 취 주사.

4. 해 부 버퍼

1. 0.195 g NaH ₂가 ₄-2 H ₂ O, 0.188 g KCl, 0.074 g CaCl ₂, 1.423 g MgCl ₂-6 H ₂ O, 12.579 g 콜린 염화 초순 (950 mL 900 mL)의 결정을 분해 . 표 1을 참조 하십시오.
2. 2.340 g 아 스 코르 빈 산, 0.342 g pyruvic 산 나트륨 소금, 2.100 g NaHCO ₃ 및 4.500 g 포도 당 결정을 분해.
3. 추가 최대 1000 mL 물. Osmolality의 범위 사이 있을 것입니다 290 mOsm/L 및 300 mOsm/l. 조정 osmolality 초순, 추가 하 여 범위 라면.
4. 5% CO ₂ 솔루션 거품 / 95% O ₂ 가스 사용 하기 전에 5 분 동안 차가운 온도에서 혼합.

5. 인공 뇌 척수 (실제)

1. 0.186 g 6.700 g NaCl, KCl과 0.156 g NaH ₂ 포의 해산 결정 ₄-2 H ₂ O 초순 (950 mL 900 mL)에. 표 2를 참조 하십시오.
2. 5 분에 대 한 가스 혼합물으로 거품
3. 1.800 g 포도 당 및 2.184 g NaHCO ₃의 결정을 분해 한 다음 4 mL MgCl ₂와 4 mL CaCl ₂ 1 M에서 재고 솔루션 추가.
4. 추가 최대 1000 mL 물. Osmolality의 범위 사이 있을 것입니다 290 mOsm/L 및 295 mOsm/l. 조정 osmolality 초순, 추가 하 여 범위 라면.
5. 거품 사용 하기 가스 혼합물 전에와.

6. 세포내 솔루션

1. 전류 클램프 녹음 (표 3), 0.0746 g KCl 해산, 대 한 6.089 g K-구 루 콘, 0.476 g HEPES, 0.0456 g EGTA, 500 µ L MgCl ₂ 1 M에서 주식 180 mL 초순에 솔루션 (pH 7.2 코와를 조정).
   0.4408 g 나 ₂-ATP, 0.0418 g 나 ₃-GTP와 0.510 g Na-phosphocreatine
   1. 추가. 200 mL에 물을 추가 하 고 코와 함께 7.35에 pH 조정.
   2. 초순 추가 하 여 약 290 mOsm/l osmolality 조정.
   3. 1 mL aliquots 냉동 실 (-30 ° C)에 게.
2. 전압 클램프 녹음 (표 4), 5.244 g CsMeSO ₃, 0.672 g CsCl, 해산 대 0.476 g HEPES, 0.0456 g EGTA, 500 µ L MgCl ₂ 1 M에서 주식 180 mL 초순에 솔루션. 7.2 CsOH와에 pH를 조정 합니다. MEPSP 및 mIPSP 녹음, 수정된 농도 5.814 g CsMeSO ₃와 0.252 g CsCl의 GABA _A 수용 체 응답 ¹¹의 역 분개 잠재력을 조정 하려면 사용 합니다.
   0.4408 g 나 ₂-ATP, 0.0418 g 나 ₃-GTP와 0.510 g Na-phosphocreatine
   1. 추가. 200 mL에 물을 추가 하 고 조정 CsOH 함께 7.35에 pH.
   2. 초순 추가 하 여 약 290 mOsm/l osmolality 조정.
   3. 1 mL aliquots 냉동 실 (-30 ° C)에 게.

7. 준비를 슬라이스

희생, 쿨 다운 ( 그림 2A) 얼음으로 모든 해 부 도구를

1. 이전. 접촉 표면 영역을 증가 얼음 용기에 냉 수의 약 500 mL를 추가 합니다. 이 절차를 설명 했다 이전 ^{10 , , 11 12}.
   참고: 도구는 여기 있다: 큰가 위, 아이리스가 위, 주걱, 마이크로 주걱, 집게, 핀셋, 스테인리스 200 mL 비 커, 트리밍, 가스 혼합물으로 치료 해 부 버퍼 가득 120 mL 심장 관류 주사기 뇌에 대 한 블레이드는 일반된 18 게이지 바늘, 스테인리스 뇌 해 부 단계에 연결 된 실리콘 튜브 (20 cm) (두께 3 m m, ϕ = = 12 cm), 및 설치 단계는 vibratome에 대 한 (ϕ = 5 cm).
2. 는 Pentobarbital (400 mg/kg 체중)의 과다와 함께 그것을 마비 하 여 행동 패러다임을 완료 한 후 30 분 쥐를 희생. 빠르게 되도록 조각 가능한 ^{10 , , 11 12}로 건강 슬라이스 준비를 수행 합니다. 두뇌 extr동작 프로토콜 우리 대학에 대 한 모든 수의 기준에 부합.
3. 차가운 해 부 버퍼 (표 1) 120 mL 주사기 5% CO ₂ 부풀어 채우기 / 95% O ₂ 가스 혼합물. 관류 전에 모든 기포를 제거.
4. 마음, 노출 후 좌 심 실의 후부 부분에 바늘을 삽입.
5. 수행 transcardial 관류 주사기를 사용 하 여 수동으로 하는 두뇌의. 큰 쥐 관류에 대 한 더 많은 해 부 버퍼를 필요로합니다. 5 분 거품 버퍼에 대 한 차가운 해 부 버퍼와 두뇌는 침수 동안 지속적으로 잠수함.
6. 트림 블레이드를 사용 하 여 대상 피 질 영역의 수지상 방향 각도 동시에 두뇌의 후부 측면. 때문에 두뇌는 컷된 끝 아래쪽으로 해 부 무대에 서 서, 초기 각도를 모든 후속 뇌 조각의 각도를 결정 합니다. 이 단계는 매우 중요 하다 ( 그림 2B). 잘못 된 각도 대상 피라미드 뉴런을 통해 잘라 수 있습니다.
   참고: 여기에 도구는: 두뇌 트리밍에 대 한 블레이드, 필터 종이 (ϕ = 10 cm), 스테인리스 뇌 해 부 무대 (두께 3 m m, ϕ = = 12 cm), 주걱는 superglue, 스 포 이트, 및 설치 단계는 vibratome에 대 한 (ϕ = 5 cm).
7. 는 350 µ m는 vibratome를 사용 하 여 두꺼운 코로나 뇌 조각 잘라. 얼음 처럼 차가운 버퍼와 해 부 챔버 5% CO ₂ 부풀어 채우기 / 95% O ₂ 가스 혼합물 ( 그림 2C). 뇌 조각 동안 지속적으로 버퍼를 거품.
8. 아이리스가 위를 사용 하 여 대상 영역의 주변 트림.
9. 세척 실제 실 온에서 부드럽게 손질된 조각 부풀어 5% CO ₂ / 95% O ₂ (표 2).
녹음 때까지 인터페이스 챔버를
10. 유지는 손질된 조각 ( 그림 2D 및 E)를 수행 합니다. 1 h는 챔버에 대 한 보육은 셀의 상태를 개선 하지만 고기 조각 이상 10 시간 동안 알을 품는 경우 변경. 묶을 가스 챔버의 뚜껑을 닫고 실제의 작은 액체 방울.

8. 전체 셀 패치 클램프

참고: 전체 셀 녹음 필요 앰프와 저역 통과 필터를 5 kHz의 컷오프 주파수로 설정 되어. 신호는 디지털화 하 고 PC에 저장. 저장 된 데이터는 분석 오프 라인 ( 그림 3A).

만들기 유리 전극 수평 끌어당기는 사람을 사용 하 여

. 적합 한 솔루션 (표 3 및 4) 전극 채우기 좋은 유리 튜브와 0.22 μ m 필터에 연결 된 일반 폴 리 에틸렌 1 mL 주사기를 사용 하 여.
1. 셀과 접촉, 이전 긍정적인 압력을 유지 하 고 전류 0를 피펫으로 조정.
2. Gigaohm 물개를 형성 후 세포 막 ( 그림 3 층에 전체 셀 구성) 파열 부정적인 압력 적용.

9. 전류 클램프 분석

1. 세포 막의
   1. 속성 입력 전류 클램프 녹음 (표 3)에 대 한 세포내 솔루션 펫을 기록 하는 패치. 4 m ω 및 7 m ω는 실제 사이 피 펫의 저항입니다.
   2. 막 파열 후-60에서 막 전압을 잡고 mV V-클램프 모드에서. 다음,에서 전환 " 목욕 " 모드를 " 셀 " 막 커패시턴스, 저항 및 시간 상수 등 기본 셀 속성을 측정 하는 소프트웨어를 사용 하 여 막 테스트에서 모드.
2. 현재 주입 연구
   1. 기본 셀 속성을 기록한 후 트랙에 V-클램프에서 모드 전환 (나 = 0) 현재 분사에 대 한 /I-CLAMP 정상. 액체 접합 잠재력 여야 수정된 ¹⁰.
   2. 300 부인에 대 한 현재 셀에 넣기에서 stepwise 전류의 강도 변경할 − 50 pA 증가와 +550 pA 100 pA. 스파이크 (활동 전위) 현재 주사 하 여 elicited 개수.
   3. (이) 활동 전위를 유도 하는 데 필요한 최소 전압 측정.
   4. Afterhyperpolarization 진폭 스파이크 개시에서 전압과 최저 전압 afterhyperpolarization ⁷ 동안 달성 간의 차이 계산.

10. 전압 클램프 분석

1. 는 AMPA/NMDA 비율
   참고: The AMPA/NMDA 비율은 glutamatergic 흥분 성의 시 냅 스 ^{7 , 8}에 postsynaptic 소성을 평가 하는 기존의 방법 ^{, 9 , 10 , 그러나 11}., 두 구성 요소에 있는 수 반하는 증가 비율 ¹³을 변경 하지 될 수 있습니다 주의.
   1. Perfuse 생리 적인 솔루션으로 녹음 실 가스 혼합물으로 부풀어 및 GABA _A-응답을 중재 하 고 4 µ M 2를 추가-차단 솔루션에 25 ° C. 추가 0.1 m m picrotoxin에 22 ° C에 온도 유지 chloroadenosine 안정 갖는 신경 응답 ¹⁴.
   2. 입력 전압 클램프에 대 한 세포내 솔루션 펫 녹음 패치 녹음 (표 4). 에 실제 기록 피 펫의 저항을 확인 하십시오. 4 m ω 및 7 m ω 사이 성이.
   3. M 1에서 레이어 II/III 피라미드 뉴런에 녹음 장소 바이 폴라 텅스텐 전극 200 µ m forelimb 표현의 영역에서 pial 표면 아래 기록에 있는 셀에 300 µ m 측면에 자극 (2 mm 옆에는 중간 선) ^{15 , , 16 17}.
   4. CA1 피라미드 신경에 기록를 위해 300 µ m 측면 (Schaffer 부수적인 섬유)을 자극 전극 200 µ m 또는 중간 (temporoammonic 통로) 됩니다 셀에 기록 ( 그림 3B).
   5. 시냅틱 응답까지 자극 강도 증가 > 10 실바
   6. AMPA/NMDA 비율 계산에서 측정 된 피크 전류 비율 − 60 현재 mV 측정 + 40 mV 150에 자극 발병 후 밀리초. 비율을 계산 50 ~ 100 트레이스를 평균 한다 참고.
2. 미니어처 postsynaptic 현재 녹음
   참고: 미니어처 흥분 성의 postsynaptic 전류 (mEPSCs) 조미료의 단일 기의 연 접 릴리스에 의해 elicited 응답에 해당 하 고 생각 된다 ¹⁸ . 반면, 소형 금지 postsynaptic 전류 (mIPSCs) 해당 GABA ¹⁸의 단일 기의 연 접 릴리스에 의해 elicited 응답 하 생각 된다. MEPSCs 및 mIPSCs의 진폭에 있는 증가 반영 postsynaptic 전송 강화, 증가 하면서 주파수 기능 시 냅 스 연 접 릴리스 확률의 수에 있는 증가 반영 하는 이벤트에 ¹¹ .
   1. -60에 수정 된 세포내 솔루션 (표 4) 조정의 GABA _A 수용 체-중재 전류 반전 잠재력을 패치 기록 피 펫을 채우기 mV.
   2. 자발적인 활동 전위를 막기 위하여 목욕에 추가 0.5 µ M 테트로도톡신.
   3. 보류-60에서 전압 mV r ~ecord 5 분에 대 한 mEPSC 이벤트
   4. 변경 0으로 잠재적인 지주 mV 5 분에 대 한 기록 mIPSC 이벤트 ~. M 1 뉴런의 mIPSCs + 15에 기록 됩니다 때문에 m 1 뉴런 약간 높은 반전 AMPA 수용 체-중재 전류에 대 한 잠재적인 표시, 0.1 m m APV mV.
   5. 전류 안정화를 위한 몇 분 동안 기다려.
   6. 5 분에 대 한 mIPSC 이벤트 기록
   7. 는 소프트웨어를 사용 하 여 미니어처 이벤트를 감지 하 고 10 pA 위의 이벤트를 사용 하 여 분석에 대 한. 주파수를 결정 하기 위해 5 분 동안 mEPSCs 또는 mIPSCs 이벤트의 수를 계산 합니다. 평균 평균 진폭을 얻기 위해 이벤트의 진폭.
   8. 목욕 치료 10 µ M CNQX 또는 10 µ M bicuculline methiodide mEPSCs 및 mIPSCs 이벤트를 각각 차단 여부 확인.
3. 쌍 펄스 분석
   참고: 연 접가 소성 결합 펄스 분석을 사용 하 여 분석 될 수 있다. 짝 주파수 증가 제안 연 접 조미료에 감소 또는 GABA 해제 확률 ^{7 , , 10 11}.
   흥분 성의 시 냅 스를 분석 하 고, 0.1 m m picrotoxin를 추가 하 고-60에 대 한 응답을 기록 하는
   1. mV. 비록 우리가 목욕에 4 µ M 2-chloroadenosine를 추가, 우리는 약 연 접 릴리스 확률 ¹⁴에 영향을 염두에 두어야 필요.
   2. 억제 시 냅 스를 분석 하는 목욕을 0.1 mM APV 4 µ M 2-chloroadenosine를 추가 하 고 0 응답 기록 mV. M1 뉴런에 + 15에 응답 기록 mV.
   3. 100 ms 또는 200 양 간 자극 간격 쌍된 펄스를 적용
   4. 각 잠재적인 들고에서 50-100 순차적 추적을 기록 하 고 평균 값.
   5. Postsynaptic 현재 첫 번째 피크에 대 한 두 번째 피크의 비로 짝된 펄스 비율 계산.

결과

우리가 설명 했 듯이 최근⁷, 회전자 봉 훈련 (그림 1A) m 1 층 II/III 피라미드 뉴런의 본질적인 소성에서 동적인 변화를 유도 한다. 대기 시간을 측정 하는 쥐 회전 막대에서가까지 쥐의 숙련 된 학습 성능을 측정 하 수 있습니다. 긴 대기 시간 더 나은 모터 성능을 나타냅니다. 교육의 날 1, 쥐 재판이 끝날 때까지 그들의 회전자 로드 성능 향상. 평균된 세션에서 하루 2, 쥐 달성 거의 점근 수준에 점수 (그림 1B). 첫 번째 재판에서 대기 시간와 비교 게시물-특별 분석 훈련 일 (그림 1C)에 최종 재판에서 상당한 개선을 보여주었다.

그림 4A 전류 클램프 분석 모터 기술 학습 후 신경 속성 변경의 예가 나와 있습니다. 400 pA 및 pA 전류 500의 각각 활동 전위 일반인된 그룹 및 1 일 훈련 된 쥐를 유도 하기 위해 필요 했다. 반면,만 150 파 전류 주입 2 일 훈련 된 쥐에 있는 활동 전위를 유도 하기에 충분 했다. 활동 전위의 수와 현재 강도 간의 관계는 그림 4B에 표시 됩니다. 작은 50 pA 현재 2 일 훈련된 쥐;에 스파이크를 유도 하기에 충분 했다 반면, 1 일 훈련된 쥐 350 pA와 더 높은 전류를 쌓지 않은 쥐 보다 적은 활동 전위와 반응. 또한, 그림 4C 는 1 일 훈련된 쥐 보였다 낮은 휴식 잠재력, 반면 2 일 훈련된 쥐 보여준 높은 휴식 잠재력 (그림 4C)와 막 저항 (높은 임계값, 그리고 깊은 afterhyperpolarization, 스파이크 그림 4D)입니다.

앞에서 설명한 우리¹¹, IA 훈련 (그림 1D) hippocampal CA1 신경의 흥분 성의 억제 시 냅 스에 postsynaptic 소성을 유도 한다. 라이트 박스에서 대기 시간을 측정 하 여 쥐의 상황별 학습 성능을 예상 수 있습니다. 그림 1E IA 작업의 결과 보여 줍니다. 쌍을 이루는 전기 충격 후 쥐 상자의 어두운 면을 방지 하 고 그들은 일반적으로 선호 하지 조명된 측면에서 배워야만. 어둠을 피하기 위해 경향이 따라서 문맥상 기억의 인수를 나타냅니다.

그림 5 는 미니어처 postsynaptic 전류 극적으로 상황별 학습 후 변경 된 전압 클램프 분석의 예가 나와 있습니다. 조사 학습 유도 소성, 자발적인 AMPA 중재 mEPSCs 및 GABA_A-중재 mIPSCs 0.5 µ M 테트로도톡신 (그림 5A 와 B)의 순차적으로 기록 되었다. 2 차원 플롯 (그림 5C)에 표시 된 대로 각 CA1 신경 mEPSCs 및 mIPSCs에 대 한 다른 말은 진폭을 했다. 진폭 낮은 좁은 범위에 보였다 했지만 일반인, 홀, 도보 쥐 그 IA 훈련 쥐 (표 5)에 다양 한 했다. 다음 post hoc 분석 ANOVA 보였다 mEPSC의 평균 진폭에 있는 상당한 증가 및 mIPSC IA 훈련 쥐 (그림 5E) CA1 신경 세포에 postsynaptic 소성 학습 유도 제안.

또한, 각 CA1 신경 다른 mEPSC와 mIPSC 주파수 (그림 5D) 전시. 주파수 낮은 좁은 범위에 보였다 했지만 일반인, 홀, 도보 쥐 그 IA 훈련 쥐 (표 6)에 다양 한 했다. 다음 post hoc 분석 ANOVA IA 훈련 쥐 (그림 5 층)에서 mEPSC 및 mIPSC 이벤트의 주파수에서 상당한 증가 보였다. 이러한 결과의 2 개의 가능한 해석이 있다. 첫 번째는 상황별 학습 기능 시 냅 스는 신경 세포의 수를 증가 했다. 다른 상황별 학습 조미료와 GABA의 연 접 릴리스 확률 증가입니다.

추가 검사 연 접가 소성, 우리 또한 실시 짝 펄스 stimulations, 이전^10,11보고.

그림 1 : 학습 훈련 후.
A: 실험 설계 회전자 봉 교육 및 코로나 뇌 조각을 보여줍니다. B: 가속 회전자 봉 총 신에서가을 대기 하는 평균 시간. C: 평균 대기 시간 막대의 첫 번째 훈련 1-2 일⁷에 최종 재판에가을. P< 0.01 대 첫 재판. D: 금지 회피 (IA) 작업 및 코로나 뇌 조각의 스키마. E: IA 훈련¹¹전후 어두운 상자를 입력 대기 하는 평균 시간. P< 0.01 대 IA 훈련 하기 전에. 코로나 섹션으로 숫자 m m에서 bregma에 앞쪽 거리를 나타냅니다. 동물의 수는 막대의 아래쪽에 표시 됩니다. 오차 막대 표시 SEM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 : 슬라이스 절차.
A: 사진 보여 급성 뇌 조각 준비. 해 부 도구는 사용 하기 전에 얼음에 냉각 했다. B: 뇌의 해 부와 트리밍. 참고 수지상 방향으로 동시에 후부 측면에서 트리밍의 각도 지향 합니다. C: vibratome 챔버에 두뇌를 슬라이스. 뇌 해 부 버퍼에 목욕 하 고 지속적으로 5% CO₂/95% O₂ 가스 혼합물으로 부풀어. D: 인터페이스 챔버를 두 개의 플라스틱 식품 용기 및 실리콘 튜브의 만든. 챔버 인공 CSF로 가득 했 고 가스 혼합물으로 지속적으로 부풀어. E: 뇌 조각 챔버에서 필터 종이에 배치 했다.바 = 5 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 : 패치 클램프 절차.
A: 신경에서 전기적 신호를 기록 하는 데 사용 하는 패치 클램프 시스템. 자극 하 고 레이어 II/III 뉴런에서 녹음 하는 전극의 위치는 쥐 모터 피 질에 표시 됩니다. B: CA1 피라미드 뉴런의 Schaffer 시 냅 스를 분석 하는 자극 전극 지층 radiatum에 배치 했다. Temporoammonic 시 냅 스를 분석 하는 자극 전극 지층 moleculare에 배치 했다. 대표 흔적 갖는 AMPA와 NMDA 수용 체-중재 흥분 성의 postsynaptic 전류 같은 CA1 신경에 표시 됩니다. C: 슬라이스 앵커 녹음 실에서 슬라이스를 안정화 하는 데 사용 되었다. D: 게시 된 논문^15,,1617에 따라 모터 피 질에서 표현 지도. ML = 중간. E: M 1의 IR DIC 현미경 레이어 전에 II/III 신경 (위) 및 (낮은) 기록 하는 동안. 바 = 10 µ m. F: 터치 (상단) 전에 고 막 파열 (하단)에서 현재 피 펫에 변화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 : 전류 클램프 분석⁷ 의 대표적인 결과 .
A: 활동 전위의 대표적인 흔적 현재 주사와 유도 후 기록. B: 말은 현재 입력 (pA) 뇌 조각에 활동 전위 출력 (스파이크의 수) 대 일반인된 (오픈 바), 1 일 훈련된 (회색 막대), 그리고 2 일 훈련된 쥐 (채워진된 바) 간의 관계. C: 휴식 잠재력, 임계값 및 레이어 II/III 뉴런의 afterhyperpolarization. D: 막 저항 및 신경 세포의 직렬 저항. 우리는 각 그룹에 9-10 쥐를 사용합니다. 셀의 수는 각 막대 내에서 표시 됩니다. 오차 막대 표시는 SEM. *P< 0.05, * *P< 0.01 대 일반인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5 : 전압 클램프 분석¹¹ 의 대표적인 결과 .
미니어처 흥분 성의 및 금지 postsynaptic 전류 (mEPSCs 및 mIPSCs) 일반인된 (A)와 억제 회피 (IA)의 대표적인 흔적-쥐 (B) 훈련. -60 mV, mV 테트로도톡신 (0.5 µ M)의 존재는 같은 CA1 피라미드 뉴런에서 순차적으로 측정 하는 0에서 mIPSCs에 mEPSCs. 세로줄 20 pA, 가로 바 = = 200 밀리초. C: 2 차원 플롯의 의미 나 (I) PSC 진폭에 일반인, IA-훈련, 홀, 및 도보 쥐. D: 나 (I) PSC의 2 차원 플롯 4 그룹에 주파수. 참고 각 CA1 신경 다른 전시 나 (I) PSC 진폭 및 주파수를 의미 합니다. IA 교육 뿐만 아니라 평균 진폭을 강화 했다 (E) 또한 증가 나 (I)의 주파수 PSC 이벤트 (F). 우리는 각 그룹에 4-6 쥐를 사용합니다. 셀의 수는 막대의 아래쪽에 표시 됩니다. 빨간색 더하기 기호 (C, D)과 수직 라인 (E, F)와 바 나타냅니다 평균 ± SEM. * *P< 0.01 대 일반인 쥐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

해 부 버퍼 (총 1 L)
NaH2포4 • 2 H2O	0.195 g	1.25 m m o l/L
KCl	0.188 g	2.5 m m o l/L
CaCl2	0.074 g	0.5 m m o l/L
MgCl2 • 6 H2O	1.423 g	7.0 mmol/L
콜린 염화 물	12.579 g	90 mmol/L
의약품	2.340 g	11.6 m m o l/L
Pyruvic 산	0.342 g	3.1 mmol/L
NaHCO3	2.100 g	25 mmol/L
포도 당	4.500 g	25 mmol/L

표 1: 해 부 버퍼에 대 한 제조 법

인공 CSF (총 1 L)
KCl	0.186 g	2.5 m m o l/L
NaCl	6.700 g	114.6 mmol/L
NaH PO42•2H2O	0.156 g	1 mmol/L
포도 당	1.800 g	10 mmol/L
NaHCO3	2.184 g	26 mmol/L
1 M MgCl2	4 mL	4 mmol/L
1 M CaCl2	4 mL	4 mmol/L

표 2: 인공 뇌 척추 액체 (CSF)에 대 한 제조 법

전류 클램프 (총 200 mL)에 대 한 세포내 솔루션
KCl	0.0746 g	5 mmol/L
K-글 루 콘 산	6.089 g	130 m m o l/L
HEPES	0.476 g	10 mmol/L
EGTA	0.0456 g	0.6 m m o l/L
1 M MgCl2	500 Μ L	2.5 m m o l/L
나2 ATP	0.4408 g	4 mmol/L
나3 GTP	0.0418 g	0.4 mmol/L
Na phosphocreatine	0.510 g	10 mmol/L

표 3: 전류 클램프에 대 한 세포내 솔루션에 대 한 제조 법 기록

전압 클램프 (총 200 mL)에 대 한 세포내 솔루션
CsMeSO3	5

.244 g (5.814) ^* 115 m m o l/L (127.5) ^* CsCl 0.672 g (0.252) ^* 20 mmol/L (7.5) ^* HEPES 0.476 g 10 mmol/L EGTA 0.0456 g 0.6 m m o l/L 1 M MgCl₂ 500 Μ L 2.5 m m o l/L 나₂ ATP 0.4408 g 4 mmol/L 나₃ GTP 0.0418 g 0.4 mmol/L Na phosphocreatine 0.510 g 10 mmol/L * 소형 녹음에 대 한 낮은 Cl^- 농도

표 4: 전압 클램프에 대 한 세포내 솔루션에 대 한 제조 법 기록

매개 변수		일반인	IA 훈련	짝이 없는	안내
mEPSC 진폭	분산	5.8	32.1	4.7	5.9
	표준 편차	2.4	5.7	2.2	2.4
	변동 계수	0.189	0.326	0.177	0.190
mIPSC 진폭	분산	17.1	56.7	31.8	20.7
	표준 편차	4.1	7.5	5.6	4.5
	변동 계수	0.279	0.387	0.367	0.286

표 5: 미니어처 흥분 성의 금지 postsynaptic 현재 (mEPSC 및 mIPSC) 진폭 억제 회피 (IA)에서 다양성-쥐를 훈련

매개 변수		일반인	IA 훈련	짝이 없는	안내
mEPSC 주파수	분산	278	2195	188	195
	표준 편차	17	47	14	14
	변동 계수	0.902	1.198	0.893	0.874
mIPSC 주파수	분산	3282	27212	1385	5135
	표준 편차	57	165	37	72
	변동 계수	1.195	1.006	0.955	0.836

표 6: 미니어처 흥분 성의 금지 postsynaptic 현재 (mEPSC 및 mIPSC) 주파수 억제 회피 (IA)의 다양성-쥐를 훈련

토론

조각 패치 클램프 방법의 주요 한계에 비보를 어떻게 반영 되지 않을 수 있습니다 슬라이스 준비에서 기록 이다. 전류 클램프 분석 vivo에서 더 안정적 이지만, 그것은 기술적으로 의식이 있는 동물에서 충분 한 데이터를 얻는 도전 이다. 각 피라미드 뉴런의 속성이 다른 세포 때문 세포의 충분 한 숫자는 제대로 훈련 후 신경에 차이 분석 하 필요 하다. 또한, 전압 클램프 분석 postsynaptic 응답의 성격을 결정 하는 CNQX, APV, 또는 bicuculline 지속적인 약물 치료를 필요 합니다. 조미료 또는 GABA의 단일 소포에 의해 유도 된 미니어처 응답 분석, 테트로도톡신 연속 치료 자발적인 활동 전위를 차단 필요 합니다. 비록 최근 개발 된 다중 광자 이미징 기술을 흥분 성의 시 냅 스¹⁹에서 형태학 상 변화를 분석 하기 위한 강력한, 결합 된 패치 클램프 기술 vivo에서시 냅 스의 기능 분석 필요 합니다. 그것은 현재 가장 억제 시 냅 스는 등뼈를 형성 하지 않습니다 이후 억제 시 냅 스에서 형태학 상 변화를 분석 하는 매우 어렵습니다. 이 시점에서 조각 패치 클램프 셀 속성 또는 훈련된 동물에 흥분 성의 억제 시 냅 스의 기능 분석에 가장 적합 한 기술 될 것 이다.

전류 클램프 분석 (그림 4)를 사용 하 여, 우리는 최근 레이어 II/III 뉴런에 모터 학습 유도 내장 소성을 했다. 특히, 1 일 훈련된 쥐 스파이크 임계값에 막 잠재력 및 증가 휴식에 상당한 감소를 보여주었다. 2 일 훈련된 쥐 휴식 막 잠재력 증가 흥분 시킨 중요 한 증가 보였다. 이 결과 제안 하는 거기 훈련 된 쥐에 M1 층 II/III 뉴런의 본질적인 소성에서 동적인 변화를 했다. 추가 전압 클램프 분석 공개 1 일 훈련된 쥐, 연 접 GABA 릴리스 확률⁷에 일시적인 감소 했다 제안에 쌍 펄스 비율에 증가 했다. 그것은 따라서 가능한 II/III synapses 계층에서 GABA에서 그 disinhibition m 1에서 결과 학습 유도 소성 시킬 수도. 이 지원 m 1의 슬라이스 준비 LTP²⁰유도 GABA_A 수용 체 차단제와 목욕 치료를 필요 합니다.

미니어처 postsynaptic 잠재력의 분석 IA 훈련 동물에 시 냅 스가 소성을 검출 하는 강력한 방법입니다. 기록 mEPSCs 및 mIPSCs에에서 순차 CA1 신경 각 개별 뉴런의 흥분 성의 억제 시 냅 스의 분석을 수 있습니다. 단일 이후 나 (I) PSC 응답은 조미료 또는 GABA, 증가 한 소포에 기인 나 (I) PSC 진폭 postsynaptic 강화 제안. 나 (I) PSC 분석을 사용 하 여, 우리는 각 CA1 신경 (그림 5C)에 흥분 성의 억제 입력의 강도에서 개별 차이 발견. IA 교육 명확 하 게 시 냅 스 강도, 다양성을 승진만이 아니라 다른 그룹 (표 5)에서 관찰 되었다.

시 냅 스 다양성 학습 유도 수학적으로 분석할 수 있습니다. 각 포인트의 출현 확률을 계산 하 여 각 뉴런에서 데이터 자체-엔트로피 (비트) Claude E. Shannon²¹의 정보 이론을 사용 하 여 변환할 수 있습니다. 매우 드문 확률 (이탈된 포인트) 점을 나타냅니다 높은 자기-엔트로피 (평균 수준)의 주위에 모양 높은 확률으로 포인트 낮은 자기-엔트로피, 나타냅니다. 익숙하지 않은 쥐에 비해 신경 당 자체 엔트로피 IA 훈련 된 쥐에 명확 하 게 증가 했지만 하지 짝이 없는 또는 도보 쥐²². 이 분석 내부 CA1 정보 상황별 학습 후에 증가 했다 나왔다.

조각 패치 클램프 기술 문장을 두려움 컨디셔닝 측면 편도⁹ 연구 및 신 피 질⁸에서 감각 경험 연구에 사용할 수 있습니다. 또한,이 기술은 추가 조사에 대 한 다양 한 다른 기술을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 바이러스 중재 녹색 형광 단백질 (GFP)-태그 유전자 전달 기술을 특정 분자의 기능을 분석 하는 패치 클램프 기술 결합 될 수 있다. 또한, 특정 신경 특정 영역을 그 프로젝트를 시각화 하는 역행 추적 프로그램의 초점 microinjection은 사용할 수 있습니다. 그런 다음 전류 클램프 기술을 사용 하 여, 휴대 전용 속성 분석할 수 있습니다 시각된 신경²³에. 또한, 조미료의 2 광자 레이저 uncaging와 결합 2 광자 레이저 스캔 현미경 척추 관련 성장과 마우스 피 질에서 EPSC 응답 레이어 II/III 피라미드 뉴런¹⁹보여 주기 위해 사용 되었습니다. 따라서, 조각 패치 클램프 기술 소설 화학, 유전자 전달와 사진 조작 기술을 결합 하 여 향상 되는.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rota-Rod Treadmills	Med Associates Inc.	ENV577
inhibitory avoidance box	Shinano Seisakusho
Pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku
Blade	Nisshin EM Co., Ltd	LC05Z
Cardiac perfusion syringe	JMS Co., Ltd	JS-S00S
Vibratome	Leica Microsystems	VT-1200
Horizontal puller	Sutter Instrument	Model P97
Microfilm 34 gauge	World Precision Instruments, Inc	MF34G-5
0.22 µm filter	Millipore	SLGVR04NL
Axopatch–1D amplifier	Axon Instruments
Digidata 1440 AD board	Axon Instruments
pCLAMP 10 software	Axon Instruments
Upright Microscope	Olympus	BX51WI
CCD camera	Olympus	U-CMAD3
Camera controller	Hamamatsu Photonics K.K.	C2741
Stimulator	Nihon Kohden	SEN-3301
Isolator	Nihon Kohden	SS-104J
Motorized manipulator	Sutter Instrument	MP-285
Micromanipulator	Narishige	NMN-21
Peristaltic Pump	Gilson, Inc	MINIPULS® 3
Glass capillary	Narishige	GD-1.5
Ag/AgCl electrode	World Precision Instruments, Inc	EP4
Slice Anchor	Warner instruments	64-0252
Stimulus electrode	Unique Medical Co., Ltd	KU201-025B
Materials	Company	Catalog Number	Comments
Dissection buffer/ artificial CSF
NaH2PO4 • 2H2O	Sigma-Aldrich Co.	C1426
KCl	Wako Pure Chemical Industries	163-03545
CaCl2	Wako Pure Chemical Industries	039-00475
MgCl2 • 6H2O	Wako Pure Chemical Industries	135-00165
Choline chloride	Sigma-Aldrich Co.	C7527
Ascorbic acid	Wako Pure Chemical Industries	190-01255
Pyruvic acid Na	Wako Pure Chemical Industries	199-03062
NaHCO3	Sigma-Aldrich Co.	28-1850-5
Glucose	Sigma-Aldrich Co.	07-0680-5
Materials	Company	Catalog Number	Comments
Intracellular solution
K-Gluconate	Sigma-Aldrich Co.	G4500
HEPES	Wako Pure Chemical Industries	346-01373
EGTA	Wako Pure Chemical Industries	348-01311
Na2 ATP	Nacalai Tesque	01072-24
Na3 GTP	Sigma-Aldrich Co.	G-8877
Na phosphocreatine	Sigma-Aldrich Co.	P-7936
CsMeSO3	Sigma-Aldrich Co.	C1426
CsCl	Wako Pure Chemical Industries	033-01953
Materials	Company	Catalog Number	Comments
Drugs in aCSF
2-Chloroadenosine	Sigma-Aldrich Co.	C5134
Picrotoxin	Sigma-Aldrich Co.	P-1675
Tetrodotoxin	Wako Pure Chemical Industries	207-15901
CNQX	Sigma-Aldrich Co.	C239
APV	Sigma-Aldrich Co.	A5282