소 대형의 강력한 셀 모델로 기본 신경 하 Microsomes 관련 알파 synuclein 집계의 외 인 관리

요약

이 프로토콜의 목표는 vivo에서집계 하는 알파 synuclein의 형성을 복제 하는 셀 기반 시스템을 제공 하는입니다. 세포내 알파 synuclein 포함은 국제화에 의해 주 뉴런에 시드는 고 세의 전파 관리 네이티브 microsomes 관련 알파 synuclein 집계 병 알파 synuclein 유전자 변형 쥐에서 분리.

초록

년, 셀 문화 흠도 불용 성 알파 synuclein (αS)의 형성을 복제의 무 능력 αS 집계에서 파 킨 슨 병 (PD)의 연구에 큰 제한 되었습니다. 최근, 질병 αS 유전자 변형 쥐 또는 PD 환자에서 뇌 추출의 외 인 접종을 통해 새로운 동물 모델의 개발 αS 집계의 더 적절 한 셀 모델의 가능성을 새로운 희망을 부여 하고있다. 불행히도, 셀 문화에 관해서, 원시 뇌 추출의 쥐에서 성공적으로 입증 되지 않은 그리고 exogenous 집계의 선택의 소스는 아직 생체 외에서 preformed αS 소.

매우 독성 αS 종 유전자 변형 생쥐의 병에 걸리는 지역에서 고립의 네이티브 microsomes 관련 된 αS, 외 인 관리를 통해 기본 신경 세포에서 세포내 αS 포함의 형성을 유도 하는 방법을 개발 했습니다. Microsomes 소포와 연결 되는 αS의이 분수 효율적으로 내 면화 하 고 세포내 포함 집계 및 phosphorylated αS에 대 한 긍정적인의 형성을 유도 한다. 생체 외에서에 비해-재조합 αS, 우리의 방법에서에서 만든 미리 형성한 소 빠릅니다 및 정통 αS 집계로 만든 병원 성 시드 보장 더를 흉내 낸 PD의 질병 동물 모델에서 추출의 종류 밀접 하 게 포함에 비보를 얻을. 그 결과, 조직 αS 포함 풍부한의 가용성은 필수입니다.

우리 믿고이 방법은 αS 집계 및 비보에 관련된 세포 이상의 미세한 측면을 연구 하는 다양 한 셀 기반 모델을 제공 합니다 더 정확 하 고 정교한 세포의 창조를 위한 출발점이 될 것입니다. PD의 패러다임입니다.

서문

알파 synuclein (αS) 배치할 포함의 축적은 Parkinson의 질병 (PD)와 알파-synulceinopathies¹의 유명 하 고 중요 한 기능입니다. 불행히도, 동물 모델 유도 집계 단계 단백질 소²의 형성에 필요한 충분 한 셀룰러 및 생 화 확 적인 환경을 제공할 수 있습니다, 하는 동안 복제 복잡 한 Lewy 몸 (파운드)의 형성-같은 집계 세포 배양에서 어렵고 도전 이다입니다.

여기는 αS 포함, 유사한 동물 모델 및 PD 환자, 경작된 한 세포에 고립 된 두뇌 마우스 기본 뉴런을 사용 하 여 얻은 단백질 집계의 형성을 유도 하는 방법에 설명 합니다. 우리의 프로토콜 αS 증상 유전자 변형 (Tg) 마우스에서 마우스 hippocampal 또는 대뇌 피 질의 기본 신경 격리 microsomes 관련 된 αS의 외 인 관리를 기반으로 합니다. 이 메서드는 αS 독성 종, 문화 매체에 추가 내 면 되 고 성숙 αS-긍정적인 집계^3,4,^{의 형성을 유발 수 있습니다 확산 및 전파 능력의 활용 5,6,,78}.

원래, 셀 문화에서 αS 소의 형성을 얻기 위해 표준 방법 일반 transfection 프로토콜 또는 중재 바이러스 감염⁹통해 해당 αS cDNA의 overexpression에 근거 했다. 두 번째 프로토콜 감염 ^{에서에서 24-48 h에 고 분자량 (HMW) 종류를 포함 하 여 불용 성 소의 형성에 주도 동안 파운드 같은 αS를 얻는 첫 번째 경우 집계 뜻밖, 낮은 효율, 그리고 셀 형식에 의존 10}. 이러한 방법의 형성 아마는 과도 한 때문 이었고 αS 단백질 금액 집계를 지시 하는 αS 나 란의 병 적인 변환 보다 불용 성 되는 불균형. 대신, 우리는 여기에서 제시 하는 기술은 αS 식 수준을 변경 하지 않습니다 하지만 세 소의 국제화로 인해 광범위 한 단백질 집계를 유도. 또한, 외 인 소의 관리를 통해 αS의 형성 하는 과정 일 또는 주 되 철저 한 공부 시간 경과 패션에 αS 포함 형성의 초기 및 중간 단계를 필요로 하 고 에 세포 생화학 변화 상관. 따라서, 우리의 방법은 현미경으로 세포 이상에 관하여 αS fibril 형성 연구에 도움이 되는 αS 집계의 휴대 전화 모델을 만드는 유용한 응용 프로그램입니다.

또한 원시 뇌의 병 αS (Tg) Transgenic 쥐^11,에서 추출 하는 있지만¹² 또는 인간의 PD 두뇌^6,13 은 Tg 또는 야생-타입 (WT) 동물, 응용 프로그램에서 αS 증 착을 유도 할 수 세포 배양에 동일한 절차의 가능성이 낮은 양의 집계에서 사용 하는 샘플 및 네이티브 αS 독성 종¹⁴분리 표준 절차의 부족 때문에 성공적으로 수 입증 되지 않았습니다. 이 때문에, 생체 외에서 미리 형성 된 소 (PFFs) αS의 지금까지 셀에 αS 포함의 유도 대 한 선택의 집계 소스 그리고 동물 모델^{3,4,6,7 ,,1516}. 그러나 우리의 프로토콜,, 우리 αS microsomes 관련 집계 종 αS Tg 마우스에서 분리 세포내 파운드 같은 αS 포함 주 뉴런에서의 축적을 일으킬 수 있는 효율적으로 보여준다.

우리 실험실에서 αS microsomes 관련 집계 종 [Prp 인간 A53T αS Tg 마우스, g 2-3¹⁷] 마우스 프리온 단백질 (PrP) 발기인의 통제 인간 A53T αS 유전자 표현 질병 안내 쥐의 척수 (SpC) 조직 으로부터 격리 됩니다. 이러한 마우스 표시 중앙 신경 시스템에 강력한 모터 역 기능 및 포함의 형성을 포함 하는 연령에 따라 신경 표현 형의 만든 phosphorylated, ubiquitinated, 및 나이의 9 달 후에 시작 하는 불용 성 αS. 모터 부전 나타나면, phenotype 마비, 후부 사지에서 시작 2-3 주에 죽음에 이르게 하는으로 급속 하 게 진화. ΑS의 축적 질환 징후를 평행 시킨다. 마우스 모터 장애의 발병에 희생 SpC, 뇌 줄기 및 소 뇌에 αS 집계의 강력한 학위를 보여줍니다. 마비 마우스를 희생 하는 설정 할 때까지 기다릴 필요가 없습니다입니다. Presymptomatic 마우스 모터 역 기능을 표시 하지 않는 9 개월 된 동물에서 가져옵니다.

프로토콜

WT 및 Tg 동물의 사용 승인 되었고 전체 국가 의해에 실험 동물 복지 및 실험 (EEC 위원회 지시 86/609, 1987 년 12 월 월 12 일 및 지침 2010/63/EU, 22 9 월 2010)에 대 한 국제 법률 준수. 이 문서에 설명 된 모든 프로토콜의 우리의 기관 동물 관리 지침을 따르십시오.

1. 격리 병 A53T αS Tg 마우스에서 Microsomes 관련 된 αS의

1. 250 m m 자당, 20 mM HEPES, 10mm KCl, 1.5 m m MgCl₂, 2 mM EDTA, 그리고 1 x 인산 가수분해 효소/효소-억제제의 구성 되는 균질 버퍼를 준비 합니다. 얼음에 버퍼를 유지 합니다.
2. 균질 신선한 또는 테 플 론을 사용 하 여 차가운 균질 버퍼 (w/v) 양의 유 봉 균질 화기, 10 15의 치기와는 1시 10분에서 조직을 냉동.
3. Microcentrifuge 튜브 및 냉장된 원심 분리기를 사용 하 여 결과 펠 릿 (P1)에 핵 및 손상 되지 않은 세포를 제거 하는 4 ° C에서 10 분 1000 × g에서 원심 분리기를 초기 homogenate (1-2 mL)를 전송 합니다. P1 삭제 합니다.
4. 깨끗 한 microcentrifuge 튜브를 상쾌한 (S1)를 전송 및 S1 냉장된 원심 분리기를 사용 하 여 두 번째 상쾌한 (S10)과 펠 릿 (P10) 4 ° C에서 20 분 동안 10000 × g에서 원심.
   참고: P10 원유 막 펠 릿 미토 콘 드리 아 및 synaptosomes를 포함 하는. P10 삭제 합니다.
5. 폴 리 탄산염 병에 상쾌한 (S10)를 전송 (> 1 mL) 및 S10는 ultracentrifuge와 고정된 각도 터를 사용 하 여 4 ° C에서 1 시간에 대 한 100000 × g에서 원심 (90 Ti).
   참고:는 상쾌한 순수 cytosol 분수는 펠 릿, P100, αS microsomes 관련 된 집계를 포함 하는 동안.
6. 균질 버퍼의 500 µ L로 P100 펠 릿 resuspend 깨끗 한 microcentrifuge 튜브 및 냉장된 원심 분리기에 4 ° C에서 20 분 동안 10000 × g에서 원심 분리기 P100 전송.
7. 삭제는 상쾌한 고 P100 균질 버퍼의 100 µ L 함께 resuspend.
   참고:이 분수는 αS microsomes 관련 된 집계.
8. 2에 대 한 샘플을 sonicate 얼음 [설정된 출력 전력 1 와트 (RMS)]에 대 한 s. -80 ° c.에 샘플 저장
9. 다음날, BCA 분석을 사용 하 여 단백질 양을 확인 합니다.

2. 서쪽 오 점

참고: αS microsomes 관련 된 집계의 생 화 확 적인 특성은 서쪽 오 점 하 여 평가 됩니다.

1. 수직 전기 기구에 그라데이션 4-20% 트리 스-글리신 polyacrylamide 젤을 캐스팅.
2. Microsomes 관련 αS 분수, 변성 샘플 버퍼에 녹아의 1 µ g를 로드 합니다.
3. 다른 우물에서 5 µ L의 단백질 표준 마커를 로드 합니다.
4. 100 V는 트리 스/글리신/SDS 단백질 마커 젤의 끝에 도달할 때까지 버퍼를 실행에 젤을 실행 합니다.
5. 기본적인 탄산 버퍼를 사용 하 여 니트로 막 단백질을 전송 (10 m m NaCO₃, 3 m m NaHCO₃, 20% 메탄올) O/N 4 ° C에서, 200 mA, 상수.
6. 차단 막 PBS 비와 실시간에서 30 분 동안 궤도 통에 5% 비 지방 건조 우유와 계면 활성 제 0.05% (PBS-T)
7. 간단히, PBS-t.로 막 씻어
8. Syn-1 (1:5, 000) 또는 pSer129 αS 항 체 (1:5, 000) PBS-T, O/N 궤도 통에 4 ° C에서에 2.5% 비 지방 건조 우유에 막 품 어.
9. 10 분 막 궤도 셰이 커에 PBS-T와 RT에 씻는 다.
10. 반대로 마우스 또는 반대로 토끼 HRP 활용 된 이차 항 체 (1:3, 000) 2.5% 비 지방 건조 우유 PBS-T에서 1 h 실시간에 대 한에 막 품 어
11. 10 분 막 궤도 셰이 커에 PBS-T와 RT에 씻는 다. 3 배를 반복 합니다.
12. 일반 화학 키트를 통해 신호를 얻을.

3. 기본 신경 문화

참고: 기본 신경 문화 WT 신생아 (P0) 마우스 해 마 나 피 (C57BL/6 호선)에서 준비 되었다. 원심 분리 단계 마이너스 전체 절차 후드를 셀 문화, 메 마른 조건에서 수행 됩니다.

1. 실시간에서 적어도 12 h 65% 질 산 솔루션으로 coverslips (18 밀리미터 Ø) 치료
2. 질소 산을 제거 합니다. Coverslips 두 번 PBS 10 배와 함께 여러 번 증류수 린스.
3. 24 잘 요리에 coverslips를 삽입 하 고 폴 리-D-리와 코트 (멸 균 증류수 또는 PBS 1 0.1 mg/mL x) 37 ° c.에 1 시간에 대 한
4. 폴 리-D-라이 신을 제거 하 고 증류수로 세 번 coverslips 세척. 필요할 때까지 4 ° C에서 그들을 저장 합니다.
5. 잘린 여 마우스 강아지를 안락사 하 고 시체에서 머리를 분리. 요리에 머리를 놓고 부드럽게 피부를 해 부 합니다.
6. 좋은 위를 사용 하 여 두뇌의 기지에서 절 개 하 여 두개골을 엽니다. 두개골의 두 반쪽을 분리 하 고 신중 하 게 그들을 제거 합니다.
7. 집게를 사용 하 여 기초에서 두뇌를 꼬집어 하 고 피 질과 해 마를 분리 합니다. 1% 페니실린/스를 포함 하는 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 매체를 포함 하는 두 개의 별도 요리에 그들을 전송.
8. 각 동물에 대 한 3.6-3.7 단계를 반복 합니다. 전체 과정은 30-45 분 이상 걸리지 않을 다는 것을 유의 하십시오.
9. 수집 된 조직 말하다 고 HBSS 매체 포함 된 트립 신 0.1%의 10 mL와 함께 두 50 mL 원뿔 튜브 (해 마)와 피 질에 대 한 하나에 그들을 전송. 37 ° c.에 7 분 물 목욕에서 품 어
   참고: 아무 동요는 필요 합니다.
10. 차단 trypsin 활동 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)과 10 µ g/mL DNase는 homogenate에 포함 된 DMEM의 1 mL를 추가 합니다.
11. 원심 분리기에 RT에 5 분 동안 200 × g에서 결과 천연된 조직 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.
    참고: 펠 릿 조직에서 해 부 셀을 나타냅니다.
12. 2 %B27, 2mm 글루타민, 포도 당 6 mg/mL, 10%를 포함 하는 도금 매체에 셀 resuspend FBS, 12.5 µ M 조미료 및 10 µ g/mL gentamicin.
13. 플레이트 해리 폴 리-D-리 신 coverslips 비율에 따라 24 잘 접시에서에 뉴런: 1 피/12 우물과 1 해 마/6 웰 스, 잘 당 약 150000/200, 000 셀에 결과. 37 ° c.에 인큐베이터에서 세포를 유지
14. 하루 후 (하루에서 생체 외에서DIV 1), 2 %B27, 10 µ g/mL gentamicin 2mm 글루타민을 포함 하는 매체 도금 매체를 바꿉니다.
15. DIV 2에서 매체의 1/3를 제거 하 고 48 h glial 오염 감소를 위한 2.5 µ M 시 토 신 arabinoside 포함 된 신선한 매체의 1/3를 추가 합니다.
16. 37 ° C에서 신경 세포를 유지 하 고 매체의 절반 3 일 마다 교체.

4. 신경 치료

참고: 치료 DIV 7에서 수행 되었습니다. 모든 단계는 무 균 조건에서 세포 문화 후드 아래 수행 됩니다. DIV 7에서 대뇌 피 질의 신경 문화 밀도의 예는 그림 1에서 그림입니다.

1. ΑS microsomes 관련 집계 희석에 대 한 원래 균질 버퍼를 사용 하 여 1 µ g / µ L 솔루션을 위해 3 다른 질병 안내 쥐의 척수에서 얻은 풀.
2. 매체의 1/3를 제거 하 고 2 %B27, gentamicin와 2 mM 글루타민 x 1 포함 된 신선한 매체 부드럽게 바꿉니다.
3. 셀 중간에 풀링된 microsomes 관련 된 αS의 1 µ g을 추가 합니다. 37 ° c.에 인큐베이터에서 뉴런을 반환
4. 1 주, 3 일 마다 신선한 매체의 1/3를 추가 합니다. 매체를 대체 하지 않습니다. 그냥 추가.
5. 1 주일 후 치료, 매체의 1/3를 제거 하 고 2 %B27, 10 µ g/mL gentamicin 2mm 글루타민을 포함 된 신선한 매체 부드럽게 바꿉니다. 3 일 마다 반복 합니다.
6. 신경 치료 (DIV 21)의 2 주 후 수정.

5입니다. 면역 형광 검사

1. PBS에서 2 %paraformaldehyde 뉴런을 수정 1 x와 5% 자당 해결책 없이 떨고, RT에 15 분 동안 화학 물질에서 증기 후드.
2. 담합 솔루션을 제거 합니다. 간단히, x, 3 회 PBS 1 씻어.
   참고: 기본 신경 스틱을 하지 않는 확실히을 폴 리 리 신 coverslips 때문에 부드럽게 세척의 모든 단계를 수행 합니다.
3. PBS 1 비 계면의 0.3% 신경 세포를 permeabilize 실시간 5 분에 대 한 x
4. 간단히, x, 3 회 PBS 1 씻어.
5. 3%와 뉴런을 품 어 PBS 1에서에서 FBS x RT, 궤도 통에 불특정 바인딩 사이트 차단에서 30 분.
6. 3%에 용 해 하는 적절 한 기본 항 체와 신경 세포를 품 어 PBS 1에서에서 FBS x, O/N 궤도 통에 4 ° C에서.
   참고: syn303 (1:1, 000), 마우스 αS (1: 200), pser129-αS (1:1, 000)와 타우 (1:10, 000) 항 체 사용 되었다.
7. X, 3 회 PBS 1 가진 항 체 솔루션 및 세척, 짧게, 제거 합니다.
8. 3%에 녹아 적절 한 형광 이차 항 체와 신경 세포를 품 어 FBS 궤도 셰이 커에 어둠 속에서 RT에 1 시간에 대 한 PBS에.
9. X, 3 회 PBS 1 가진 항 체 솔루션 및 세척, 짧게, 제거 합니다.
10. DAPI 솔루션 뉴런을 얼룩 (0.1 µ g/mL PBS 1에에서 x) 궤도 셰이 커에 어둠 속에서 RT에서 15 분.
11. X, 3 회 PBS 1 가진 항 체 솔루션 및 세척, 짧게, 제거 합니다.
12. Antifade 설치 매체를 사용 하 여 슬라이드에 coverslips를 탑재 합니다.

결과

프로토콜에 따라 위에서 설명한 그림 2에 요약, 우리 3 병 A53T αS Tg 쥐 (그림 3)에서 αS microsomes 관련 집계를 정화. Microsomes는 조 막 펠 릿 분수 바인딩과 그물, 골, 작은 시 냅 스 소포를 포함 하는. 다른 부분에 비해 microsomal 펠 릿의 순수성의 정도 특정 세포 기관이 마커¹⁸를 사용 하 여 평가 이전 되었습니다.

절연, 일단 αS의 생 화 확 적인 특성은 변성 SDS-페이지, Syn-1 또는 떠들고 129 (pSer129-αS) 항 체에 phosphorylated αS 부 화 뒤를 통해 평가 됩니다. Presymptomatic (PreS)와 일치 하는 나이 비-Tg (nTg) 쥐, microsomes αS 집계 아픈 마우스 공동 침전에서 격리에 비해. Microsomes 관련 된 αS 종 αS 집계 HMW 세제 저항 종, 떠들고 129¹⁹ 와 C 인 산화의 축적 등의 일반적인 기능을 표시-N 맨끝 파편 (의 전체 특성에 대 한 잘립니다 및 αS microsomes 관련 집계 기준^18,,2021참조). 이들은 기본 사항 단위체 αS 않습니다 하지 얻을 효율적으로 내 면 이후 αS 증 착^7,,1522를 유도 하지 않습니다. 그것은 P100 펠 릿 세포에 유해한 수 있기 때문에 resuspend를 이온 (비 이온) 어떤 세제를 사용 하지 해야 합니다. 또한, 샘플 변화를 방지 하기 위해 세 가지 다른 병에 걸린 쥐에서 αS microsomes 관련 집계 풀링됩니다 신경 치료에 대 한.

관리의 풀링된 microsomes 관련 αS 병 A53T 쥐에서 피 질 또는 hippocampal 신경 세포의 배양에 1 µ g의 αS 포함와 같은 집계 관련 αS 항 체에 대 한 긍정적인의 시간에 따른 형성 유도 Syn303 (그림 4, 5) 또는 pser129-αS (그림 5). 2 일 후 (2d) 치료 이러한 집계 나중 시간 지점에서 더 풍부한 될 것입니다 작은, 뿌려 진 puncta로 나타납니다. 2 주 후, αS 포함 긴 닮 고 구슬 모양의 구조를 무 겁 게 성숙 neurite 패턴 부분적으로 공동 연 접과 지역화는 신경 문화에 걸쳐 확산 neurites 마커 (그림 5). 때때로, 새로 형성된 된 αS 포함 공동 지역화 및 셀 소마 얼룩 또는 전체 프로세스를 닮은 괴 neurites 커버를 볼 수 있습니다.

ΑS microsomes 관련 집계 분수 신경 문화에서 효율적으로 확산 될 수 있습니다, 그들의 양을 세밀 하 게 신경 도금 (그림 1)의 수를 조정 해야 있다. 사실, 권장된 비율, microsomes 관련 집계의 µ g을 초과: 뉴런의 숫자 microsomes 관련 된 αS의 부족 한 금액으로 이어질 것입니다 하는 동안 며칠 내에 (그림 6), 조 세포 죽음을 유도 것 이다는 무슨 유사한 치료 2 주 후 포함의 부족 및 감소 된 수는 이전 시간 포인트(그림 4)에서 얻은 했다.

그림 1 . 대뇌 피 질의 신경 문화입니다. 대뇌 피 질의 신경 문화 사업부 7에서 밀도 표시 하는 대표 이미지. 이미지는 거꾸로 가벼운 현미경, 10 X 목표와 함께 찍은. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2 . Microsomes 관련 된 αS의 절연 마우스 SpC에서에서 집계. Microsomes 관련 된 αS의 정화 프로토콜의 순서도 병에 걸린 쥐의 SpC에서 집계합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3 . 질병, presymptomatic A53T αS 안내 및 nTg 쥐에서 microsomes 분수의 절연. 서쪽 오 점 분석 보여주는 정화 αS microsomes 관련 된 집계에서 3 병 (병), 절연 presymptomatic (PreS)와 일치 하는 세 nTg 쥐. 병에 걸린 생쥐는 presymptomatic 동물 건강 한 A53T는 αS 포함의 축적을 포함 하 여 모터 및 신경 장애를 나타내는 A53T αS Tg 마우스 αS 표시 되지 않는 나이 아직 어떤 αS 병리학의 9 개월의 Tgs 관련 표현 형. nTg 마우스 αS transgene를 수행 하지 않는 및 따라서 αS를 개발 하지 않는 병에 걸린 쥐의 littermates 유발 병 리는. 각 정제 분수의 1 µ g 변성 SDS 페이지에서 실행, 니트로 멤브레인에 전송 되었고 Syn-1 또는 pSer129 αS 항 체와 얼룩이. Microsomes 분수 격리 아픈 쥐에서 포함 된 HMW 세제 저항 αS 집계 했다 떠들고 129에 phosphorylated 고 C만-및 N 맨끝 잘림. 이 그림에서 콜라 외 적응 되었습니다. ¹⁸. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4 . 시간에 따라 microsomes 관련 된 αS의 관리 후 αS 증 착의 감 응 작용. (A) 기본 hippocampal 신경 세포의 면역 형광 검사 치료 1 µ g의 microsomes 관련 αS 분수 3 다른 병에 걸린 쥐에서 풀링된 집계. 뉴런 일 2 고정 했다 (제 2), 1 주 (1w) 또는 처리와 syn303와 immunostained의 2 주 (2w) (S303, 1:1000), 항 체에 대 한 특정 산화 및 αS를 집계. 셀은 DAPI와 counterstained 했다. 공초점 이미지 공초점 현미경, 63 X 목표 스캐닝 레이저를 사용 하 여 찍은 사진. 눈금 막대 배경 빼기 후 50 µ m (B) 정량 분석 총 fluorescence, =, 이루어졌다 이미지 J 소프트웨어의 입자 수 플러그인을 사용 하 여. 값 필드 (DAPI 카운트) 핵의 수에 대 한 표준화 되었고 2D에서 S303 형광 신호에 대 한 비율로 표시. 값은 평균 ± SD로 부여 됩니다 (n = 5). * * p < 0.001, * * * p < 0.00001, 단방향 ANOVA, 피셔의 LSD 게시물-특별 시험 다음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5 . 대뇌 피 질의 neurites 네트워크와 세포내 αS 포함 colocalize. 대뇌 피 질의 뉴런의 대표적인 confocal 이미지 치료 질병 안내 생쥐에서 얻은 αS microsomes 관련 된 집계. 후 2 주 치료 뉴런의 고정 되었고 이중 집계 특정 항 체 [S303 (A, B) 또는 pser129-αS, 1:1,000 (C)]와 [마우스 αS, 1: 200 (A, B) 또는 타우, 1:10,000 (C)] neurite 마커 스테인드. 공동의 형광 신호 라벨 부분 공동 지역화 neurites 네트워크와 새로 형성된 된 αS 구슬 모양의 구조 설명. 때때로 αS 포함 (A, B, 화살촉) 신경 소마 내 축적. 스택된 이미지 confocal 현미경, 63 X 목표 스캐닝 레이저와 함께 인수 했다. 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림에서 콜라 외 수정 되었습니다. ²⁰. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6 . Microsomes 관련 된 αS의 차선 금액의 추가 신경에 독성 이다. 셀 죽음에 이르게 DAPI microsomes 관련 된 αS의 농도 증가 함께 치료 하는 뉴런의 얼룩. (A) 대뇌 피 질의 신경 치료 1, 2 µ g microsomes 관련 된 αS의 병에 걸린 쥐에서 추출 또는 포함 하지 않는 유일한 버퍼 (B)를 집계 하 고 DAPI 스테인드. 형광 이미지는 20 X 목표를 사용 하 여 피 형광 현미경으로 인수 했다. 눈금 막대 = 100 µ m.(B) DAPI 긍정적인 세포 이미지 J 소프트웨어를 사용 하 여 계산 했다. 그래프는 신경 미디어에 추가 된 microsomes 관련 된 αS의 농도 증가 함께 핵의 수에 있는 감소를 보여 줍니다. 값 b의 %로 표현 되 고 평균 ± SD로 받는다 (n = 5), * * * p < 0.0001, 단방향 ANOVA, 피셔의 LSD 게시물-특별 시험 다음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

우리를 αS Tg 동물 모델에서 격리 순화 microsomes 관련 된 αS의 추가 통해 WT 쥐에서 신경 주 문화 두뇌 파생 된 αS 포함의 형성을 받는 방법을 설명 합니다.

이 프로토콜의 중요 한 단계는 다음: αS microsomes 관련 된 집계/뉴런의 µ g과 αS의 소스 비율. 그것은 이후 조 세포 죽음 또는 너무 부족 한 세포내 집계 이어질 수 있는 최적이 조건에서 작업 αS microsomes 관련 된 집계/신경의 수의 µ g의 비율을 최적화 하는 중요 한 결과 세션 같이 (참조는 대표적인 결과 섹션)입니다. 이 때문에, 그것은 매우 치료를 시작 하기 전에 신경 문화 사업부 7 ( 그림 1참조)에서 밀도 평가 하는 것이 중요. 또한, αS 집계 병 αS 안내 쥐, 즉에서 정화 해야 합니다. 누적 된 동물 모델에서 파운드 같은 포함 특징 phosphorylated 세제 불용 성 αS HMW 소.

이 프로토콜에 대 한 가능한 수정에 대해 조직, 냉동 또는 신선한, 어떤 microsomes 격리 될 수 있습니다 및 시작에서. 우리 αS 불 용해성의 높은 내용 때문에 SpC의 안내 마우스를 사용, 지역 αS 집계에 있는 높은 콘텐츠를 프로토콜을 어떤 조직에서 microsomes 관련 집계를 분리 하 적당 하다. 동결의 microsomes 관련 된 집계를 집계 라기보다정화 단계를 영향을 주지 않으므로 냉동된 샘플도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 microsomes에서 얻기를 위해 적합 한 조직에 대 한 권장된 시작 무게는 약 100-150 mg, 원료 (최대 중량 제한 없음)의 50 밀리 그램으로 낮은. 그러나 100 mg 보다 낮은 금액의 경우, 적합 한 균질 비율 있을 것입니다 1:20 (w/v) 적어도 1 mL의 표면에 뜨는 S10 ultracentrifuge 강 수에 대 한 폴 리 탄산염 병에 로드 하는 순서. 사실, 1 mL 보다 작은 볼륨을 로드 튜브 및 샘플 손실의 붕괴 될 수 있습니다. 더 희석된 상쾌한 이어질 것입니다 균질 볼륨 증가 하지만 microsomal 펠 릿의 농도 영향을 받지 유지 됩니다.

이 프로토콜의 한계는 비효율적인 크로스-시드 αS 포함 최근 보고 된 인간 근원의 αS PFFs의 사례 관리에 마우스 αS PFFs²⁴반대 murine 신경 문화 형성에 염려 한다. 다른 αS 변종 또는 다른에서 소의 관리의 경우 microsomes 관련 집계의 양을 정밀 하 게 조정 하는 것이 좋습니다 murine 문화에 주어진 세 αS 소의 양을 늘리면이 문제를 무시할 수 있습니다, 이후 우리가 설명 보다 마우스 신경 문화 종.

문화 미디어에 추가 하는 외 인 αS 집계는 서로 다른 소스에서 수 있습니다. ΑS PFFs 체 외에서 세포 배양, 기본 신경 세포 및 동물 모델^3,7,,815에 세포내 αS의 시드 템플릿으로 이전 사용 되었습니다. 어디 αS microsomes 관련 집계는 몇 시간에서 고립 될 수 있다 우리의 방법에 비해 PFFs의 형성은 길고 힘 드는, purifications, αS confomations^{25 집계 확인 하기 추가 분석 실험에 의해 다음의 여러 단계를 요구} . 또한, PFFs 박테리아 표현 인간 또는 마우스 αS에서 취득 되 고, 즉 부족 posttranslational 수정, 진핵생물의 전형적인 수 다른 conformations와 현재 선택적 시드 병원 성 속성에 따라 nucleation 프로토콜 (예: 리본 vs 소)^5,8 다른 결과 및 결론에 따 랐 다. 대신, αS 집계에 vivo에서 정화의 단일 관리 동물 모델 및 PD 환자에서 αS 포함의 형성 과정을 밀접 하 게 흉내 낸 더 본격적인 병원 서식 파일의 전송을 보장 합니다.

이 기술의 미래 응용 프로그램,으로 우리 믿는 것이 프로토콜 사용할 수 있습니다 성공적으로 PD 환자의 뇌 또는 다른 αS Tg 동물 모델에서 αS 병원 성 종자를 격리 하 병에 걸리는 지역에서 microsomes 격리 된 풍부한 αS에 제공 흠입니다.

우리의 지식, vivo에서 PD 모델 시드 αS 포함 주 뉴런에서의 형성을 얻기 위해 서식 파일으로 사용할 수에서 αS의 기본 독성의 정화를 허용 하는 첫 번째 방법입니다.

우리는이 방법은 매우 다목적 이며 αS 집계 및 셀 이상에 미치는 영향의 다양 한 측면을 연구 하는 뛰어난 셀 기반 모델을 제공할 수 있습니다 믿습니다. ΑS 포함 형성 대표 배양된 세포에서 복제 하기 어려운 복잡 한 과정, 때문에 우리는이 모델 급성 병원 성 기계 장치, 만성 및 더 정교한 식별 하드에 큰 통찰력을 제공할 것입니다 희망 시스템은과 같은 동물 모델은.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sucrose	Sigma-Aldrich	84097-1KG
Hepes	Sigma-Aldrich	H0887-100ML	1M pH=7-7.6
EDTA	Sigma-Aldrich	0390-100ml	pH=8 0.5M
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
NaCO3	Sigma-Aldrich	S7795-500G
NAHCO3	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Methanol	Sigma-Aldrich	322415-6X1L
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-500G
cOmplete Mini	Roche	11836170001	protease inhibitor
PhosStop	Roche	4906837001	phosphatase inhibitor
BCA Protein Assay Kit	Euroclone	EMPO14500
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 18 wells	Biorad	5678094
Supported Nitrocellulose membrane	Biorad	1620097	0.2 μm
Blotting-Grade Blocker	Biorad	1706404	Non-fat dry milk
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate	Termo Fisher Scientific	34077
Nitric acid	Sigma-Aldrich	1004411000	65%
Glass Coverslips	Termo Fisher Scientific	1014355118NR1	18 mm x
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
Hank's Balanced Salt Solution	Termo Fisher Scientific	14170-500 mL
Penicillin/Streptomycin	Termo Fisher Scientific	15140122	10,000 U/mL, 100 mL
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium	Termo Fisher Scientific	D5796-500 mL
Trypsin-EDTA	Termo Fisher Scientific	15400054	0.50%
B27 Supplement	Termo Fisher Scientific	17504044	50X
Glutamax	Termo Fisher Scientific	35050-038	100x
DNAse	Sigma-Aldrich	D5025
Fetal bovine serum	Euroclone	EC50182L
Glutamate	Sigma-Aldrich	1446600-1G
Gentamicin	Termo Fisher Scientific	15710	10 mg/ml
Neurobasal Medium	Termo Fisher Scientific	10888-022
Cytosine arabinoside (AraC)	Sigma-Aldrich	C3350000
VECTASHIELD antifade mounting medium	Vector Laboratories	H-1000
DAPI	Termo Fisher Scientific	62247
90 Ti rotor	Beckman	N/A	Ultracentrifuge rotor
Optima L-90K Ultracentrifuge	Beckman	N/A
Syn-1 antibody, clone 42	BD Biosciences	610786	anti-mouse WB: 1:5000
Syn303 antibody	BioLegend	824301	anti-mouse IF: 1:1000
Tau antibody	Synaptic Systems	314 002	anti-rabbit IF: 1:10,000
pser129-αS antibody	A gift from Fujiwara et al, reference 19		anti-rabbit WB: 1:5000
pser129-αS antibody	Abcam	ab51253	anti-rabbit  IF: 1:1000
Mouse αS (D37A6) XP	Cell Signaling	4179	anti-rabbit IF 1:200
Alexa fluor 555-conjugated anti-rabbit antibody	Termo Fisher Scientific	A27039
Alexa fluor 488-conjugated anti-mouse antibody	Termo Fisher Scientific	A-11029
Microson XL-2000	Misonix		Sonicator
Ultra Bottles (Oakridge Bottles), PCB, 16x76mm, Assembly, Noryl Cap, Beckman-type	Science Service EU	S4484	Ultracentrifuge tubes
AXIO Observer Inverted Light Microscope	Zeiss	N/A
TCS SP2 laser scanning confocal microscope	Leica	N/A
Inverted epi-fluorescence microscope	Nikon	N/A
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML	Nonionic surfactant