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요약

세균성 세포의 화상 진찰은 큰 거대 분자 기계의 기능을 지시하는 정적 및 동적 프로세스를 정의에 초점을 맞춘 신흥 시스템 생물학 접근입니다. 여기서, 정량적 라이브 세포 영상 및 극저온 단층 촬영의 통합은 레지오넬라 뉴모필라 형 IV 분비 시스템 아키텍처 및 기능을 연구하는 데 사용된다.

초록

레지오넬라 뉴모필라의 도트/Icm 분비 시스템은 박테리아 극에서 국소화되고 표적 세포에 단백질 및 DNA 기판의 전달을 중재하는 복합형 IV 분비 시스템(T4SS) 나노머신으로, 일반적으로 직접 세포 간 접촉을 요구하는 과정이다. 우리는 최근에 극저온 전자 단층 촬영 (cryo-ET)에 의해 Dot /Icm 장치의 구조를 해결하고 세포질 복합체에 연결되는 세포 봉투 에 걸친 채널을 형성하는 것으로 나타났습니다. 견본의 토착 구조물, 살아있는 세포 및 극저온 ET에 있는 형광 현미경 검사법, 단백질의 초기 시각화및 그밖 점/Icm subunits에 상대하여 각 기계 분대의 stoichiometry 그리고 생산의 타이밍을 보존하는 2개의 상보적인 접근을 적용하십시오. 극성 포지셔닝에 대한 요구 사항을 조사하고 T4SS 기계 생물 발생과 관련된 동적 특징을 특성화하기 위해, 우리는 염색체에 그들의 기본 위치에서 도트 / Icm ATPase 유전자에 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 융합했다. 다음 방법은 살아있는 세포의 정량형 형광 현미경 검사법을 통합하고 저온-ET는 그대로 세균 세포에서 이러한 단백질의 편도적 국소화, 역학 및 구조를 정량화합니다. 레지오넬라 폐렴구균 T4SS를 연구하기 위한 이러한 접근법을 적용하는 것은 도트/Icm 시스템의 기능을 특성화하는 데 유용하며 T4SS 또는 다른 유형의 세균 분비 복합체를 활용하는 다양한 세균성 병원체를 연구하는 데 적합할 수 있다.

서문

레지오넬라 폐렴구균 (L. 폐렴구기),군단의 병인 에이전트' 질병의, 민물 저수지에 살고, 여기서 박테리아는 감염 과 수생 자유 수영 원생 동물 내에서 복제하여 전파. L. 폐렴구균은 식수원에서 에어로졸화된 박테리아를 흡입할 때 인간에게 질병 발병을 일으킨다. 감염된 세포에서, 숙주 통로의 전복은 L. 뉴모필라가 상주하는 환액의 내분비 성 성숙을 지연시키고 세균 복제를 지원하는 세포 구획의 생물 발생을 촉진할 수 있게 합니다. 이 과정은 도트/Icm으로 알려진 특수 세균형 IVB 분비 시스템(T4BSS)과 감염 시토솔로 전이되는 300개 이상의 "이펙터" 단백질의 레퍼토리에 의해 구동되어 세포 기능의조작을용이하게 하기 위해1, 2,3,4,5. 기능성 도트/Icm 장치가 결여된 돌연변이체는 숙주 시토솔내로 이펙터를 전달하지 못하고, 세포내 복제에 결함이 있으며, 질병6,7의동물 모델에서 항법성이다.

많은 세균종은 감염 과정에 필요한 매우 복잡하고 역동적인 다성분 기계를 개발했습니다. 도트/Icm 시스템과 같은 다른 T4BSS는 콕시엘라 버네티와 리케티엘라 그릴리와같은 세균성 병원체의 세포내 복제에도 필수적입니다. T4BSS는 DNA 전달을 중재하고 이펙터 단백질의 제한된 레퍼토리를 전달할 수 있는 프로토타입 유형 IVA 시스템과 진화적으로 관련이 있지만, Dot/Icm 시스템은 거의 두 배에 달하는 기계 성분을 가지고 있으며 다양한 이펙터를 제공합니다. 아마도, 구성 요소의 수의 이 확장은 쉽게8,9새로운 이펙터를 수용하고 통합 하는 점 /Icm 장치를 가능하게했다.

우리는 최근에 극저온 전자 단층 촬영 (cryo-ET)을 사용하여 도트 / Icm 장치의 구조를 해결했으며 세포 종역학 복합체에 연결되는 세포 봉투 스패닝 채널을 형성하는 것으로 나타났습니다. 추가 분석은 세포질 ATPase DotO와의 상호 작용을 통해 L. 폐렴 구균 세포 극에서 도트 /Icm 시스템과 연관된 세포 토졸릭 ATPase DotB가 있음을 밝혔다. 우리는 DotB가 대부분의 세균성 세포에 있는 세포토솔릭 운동을 표시한다는 것을 것을을 발견했습니다, 이 ATPase가 동적 세포토실 인구에서 존재하고 또한 극성 점/Icm 복합체와 연관된다는 것을 나타내는. 또한 DotO는 내부 멤브레인 복합체와 관련된 DotO 이형제의 hexameric 어셈블리를 형성하고 DotB hexamer는이 세포질 복합체의 기지에 결합합니다. DotB-DotO 에너지 복합체의 조립은 T4SS(그림1)10을통해 기판의 전좌를 지시하는 세포질 채널을 생성한다.

이러한 최근의 발전에도 불구하고, Dot/Icm 시스템이 어떻게 기능하는지, 그리고 각 단백질이 어떻게 조립되어 활성 장치를 형성하는지에 대해서는 거의 알려져 없다8. Dot/Icm T4SS의 규제 회로를 밝히는 것은 호스트 병원체 상호 작용의 분자 메커니즘을 이해하는 데 기본적입니다. 따라서, 우리는 슈퍼 폴더 GFP (sfGFP)로 태그가 지정된 필수 L. 폐렴 구균 도트 / Icm 시스템 구성 요소를 감지하고 특성화하기 위해 라이브 세포 현미경 검사법 및 저온 ET를 사용하는 방법에 대해 논의합니다. 정량형 형광 현미경 을 사용하여 DotB의 극성 국소화는 야생 형 배경 또는 유형 IV 시스템이 삭제될 때 정의됩니다. 시간 경과 현미경 검사법은 도트 / Icm cytosolic ATPases 사이의 국소화 와 역학의 차이를 정량화하는 데 사용됩니다.

라이브 이미징 및 저온-ET와 같은 두 가지 상보적 접근법의 결합된 적용은 다른 체외 시스템에 비해 이점을 제공합니다. 두 방법 모두 손상되지 않은 세포에서 수행되고 T4BSS의 자연 환경을 보존하므로 샘플 준비 중에 기본 구조의 중단을 최소화합니다. 단백질의 과발현은 분비 장치의 stoichiometry를 손상시킬 수 있기 때문에, sfGFP 융합은 레지오넬라 염색체에 대한 모든 유린교환을 통해 반환되어 각 융합이 단일 카피로 인코딩되고 발현은 내인성 프로모터에 의해 구동된다. 염색체 로 인코딩 된 융합의 시각화는 정의 된 시점에서 발현되는 단백질의 정확한 수준을 정량화 할 수 있습니다. Cryo-ET는 또한 분비 시스템의 구조를 결정하는 많은 장점을 가지고 있습니다. 가장 주목할만한 장점은 cryo-ET 샘플이 박테리아 세포 아키텍처의 맥락에서 기본 복합체를 보존하는 냉동 그대로 의 세포로 구성되어 있다는 것입니다. 따라서, 저온-ET는 막 복합체를 추출하고 핵심 장치에서 말초 단백질을 제거하거나 전체 구조를 변형시킬 수 있는 생화학적 정제 접근법보다 바람직할 수 있다. 또한, sfGFP와 같은 부피가 큰 단백질로 관심 있는 단백질을 태깅하면 저온 ET에 의해 검출가능한 질량을 추가하고 저온-ET에 의해 얻어진 구조에 도트/Icm 장치의 상이한 소복합체를 매핑하는 데 도움을 줄 수 있다.

이 접근은 세균성 세포막에서 집합하는 다분자 복합체에 관하여 구조적인 정보를 밝히기 위한 강력한 공구입니다. 이러한 기술을 사용하여 해명된 구조의 해석은 현장에서 T4BSS 구성 요소가 작동하는 방식, 함수에 필요한 이유, 구성 요소가 더 복잡한 내에서 상호 작용하는 방법 및 이러한 기능을 이해하는 데 도움이 됩니다. 하위 어셈블리가 수행됩니다.

프로토콜

참고: L. 폐렴구균의 성장, 조작 및 이미징과 관련된 모든 절차는 현지 지침에 따라 생물학적 안전 수준 2 실험실에서 수행되어야 합니다.

1. 말기 교환 및 이중 선택 전략을 사용하여 L. 폐렴 구균 염색체에 sfGFP 삽입(그림 2, 그림 3)

  1. 유전자 치환 벡터 pSR47S11내로 클론하기 다음 서열: 관심 부위의 1,000 bp 상류, sfGFP 서열, 그 후 관심 부위의 1,000 bp 다운스트림(도2). sfGFP 서열은 4~8개의 아미노산을 포함하는 링커로 N-종단 또는 C-종단 끝에 프레임에 배치되어야 한다. 생성된 벡터를 대장균 DH5αλpir로 변환합니다. 나중에, 줄무늬 L. 폐렴구균(수용자)은 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 숯효모 추출물(CYE) 한천(agar12)에 대한 단일 콜로니에 대해 37°C에서 5일 동안 성장한다(그림3).
  2. CyE-agar-스트렙토마이신에 대한 줄무늬 L. 폐렴은 37°C(무거운 패치)에서 2일 동안 성장한다(무거운 패치)10. 25 μg/mL 클로람페니콜을 함유하는 LB 한천에서 pRK600 도우미 플라스미드(helper)13으로 변형된 대장균 DH5α. 50 μg/mL 카나마이신을 함유하는 LB 한천에 대장균 DH5αλpir(기증자)를 줄무늬.
  3. 삼부모 짝짓기를 수행: 도우미의 콜로니를 배양, 기증자의 식민지, 및 선택없이 CYE 한천 플레이트에 세 균주의 패치를 오버레이하고 37 °C에서 4-8 시간 동안 배양하여 받는 사람. 부정적인 대조는 같은 기간 동안 도우미 + 받는 사람 변형 믹스와 기증자 + 받는 사람 변형 믹스를 인큐베이션으로.
  4. ddH 2 O. Plate 20 μL 및 50 μL의 ddH2o. 플레이트에서 짝짓기 반응을 재개하고 100 μg/mL 스트렙토마이신과 10 μg/mL 카나마이신을 함유한 CYE 한천에 대한 반응의 50μL을 37°C에서 5일 동안 성장시다. 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 CYE 한천상에 생성된 클론의 4척을 37°C에서 5일 동안 성장시다.
  5. 5% 자당 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 CYE 한천에 16개의 클론을 연속하고 37°C에서 5일 동안 성장한다. 이어서, 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 CYE 한천과 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 10 μg/mL 카나마이신을 함유하는 CYE 한천에 이들 클론의 32개가 37°C에서 5일 동안 자랍니다.

2. L. 폐렴구균 염색체에 sfGFP를 통합한 클론 분리

  1. CYE-한천-스트렙토마이신 플레이트상에서 카나마이신에 민감했던 클론을 연속하여 콜로니 PCR로 염색체내로 sfGFP의 삽입을 확인한다. sfGFP 유전자 및 관심 있는 염색체 영역에 상보적인 프라이머를 사용하여 삽입 접합을 증폭시다.
    1. 10 μM 프라이머 용액과 1개의 콜로니각각의 0.5 μL을 최종 부피 12.5 μL에 혼합하고 95°C에서 10분 동안 변성한다. 10분 동안 얼음에 식히고, 2x PCR 마스터 믹스 용액 12.5 μL을 추가하고, PCR 분석을 수행합니다.
  2. 37 °C에서 2 일 동안 CYE-agar-스트렙토 마이신 플레이트에 고립 된 식민지의 무거운 패치를 성장. 항-GFP 항체로 면역블롯팅에 의해 sfGFP 융합의 발현 수준 및 안정성을 검사한다.

3. 형광 태그 도트 / Icm 구성 요소와 L. 폐렴의 라이브 세포 이미징

  1. 아가로즈 패드의 준비
    1. 물에 1% 저용융 아가로즈 용액의 약 30 mL을 확인합니다. 아가로즈가 완전히 용해될 때까지 유리 플라스크에 약 90년대동안 전자레인지에 돌리며 가끔 씩 소용돌이치기.
    2. 25 x 75 x 1.1mm3 유리 슬라이드의 가장자리에 2개의 22 x 22 x 0.15mm3 유리 슬라이드를 놓고 다른 슬라이드 위에 놓습니다. 다른 가장자리에 22 x 22 x 0.15 mm3 유리 슬라이드 를 두 개 더 쌓습니다.
    3. 용융 아가로스의 약 1 mL을 두 개의 상부 유리 슬라이드 사이의 중앙 슬라이드로 피펫을 넣고, 용융 된 아가로오스 위에 또 다른 25 x 75 x 1.1 mm3 슬라이드를 놓습니다. 기포의 형성을 피하십시오. 슬라이드를 4°C에서 15분간 식힙니다.
    4. 메스 나 면도날을 사용하여 패드를 작은 사각형으로 부드럽게 자르고 ~ 5 x 5mm2로자릅니다. 양면 접착제 17 x 28 x 0.25 mm3 프레임을 25 x 75 x 1.1 mm3 유리 슬라이드에 고정하고 슬라이드에 여러 개의 패드를 놓습니다.
  2. 이미지 수집
    참고: 다음 단계는 SlideBook 6.0의 제어하에 있고 솔리드 스테이트 조명기, CCD 흑백 카메라 및 100x 대물 렌즈(1.4수치 조리개)가 장착된 현미경에 대해 설명합니다. 필요한 경우 프로토콜 설정에 따라 사용자 지정할 수 있는 적절한 하드웨어 및 소프트웨어 구성이 있는 대체 현미경 장치를 사용하십시오.
    1. DdH2O, 소용돌이 및 피펫 2-3 μL의 1 mL에 L. 폐렴구균의 무거운 패치를 패드에 용해시다. 50 x 24 x 0.15 mm3 커버슬립을 접착 프레임 위에 부드럽게 놓습니다.
    2. 캡처 창에서 ND를 180으로 조정합니다. 비닝을 2×2로 조정하고 488 nm 채널을 사용하여 500-1,000 ms 사이의 샘플을 노출시재합니다.

4. 도트/Icm 부품의 극성 국소화 및 역학 정량화

참고: 다음 단계는 픽셀당 0.129μm의 이미지를 위해 설계되었으며, 이 단계는 2 x 2 비닝으로 획득되었습니다.

  1. sfGFP 융합 단백질에 대한 극성의 정량화(그림 5)
    1. 박테리아가 선명히 보이지 않도록 이미지 대비를 조정합니다. 영역 도구를 사용하여 극에서 시작하여 세포질로 확장되는 0.25 x 1.3 μm2 직사각형을 배치합니다. 사각형은 박테리아 테두리 내에 정확하게 유지되어야 합니다.
    2. 적어도 200개의 박테리아를 표시하고 영역을 마스크 버튼을 사용하여 관심 있는 영역에 마스크를 만듭니다. 마스크 통계 및 마스크 범위에서 개체를 선택합니다. 그런 다음 피처 및 강도아래에서 평균 강도 및 분산을 표시합니다.
    3. 데이터를 내보내고 각 박테리아의 극성 점수를 평균 강도에 대한 분산 사이의 비율로 계산합니다.
    4. 처리량이 높은 애플리케이션의 경우 위상 목표와 적절한 콘덴서 설정을 사용하여 위상 및 488nm 채널을 사용하여 이미지를 수집합니다. 박테리아가 완전히 분리된 시야를 선택해야 합니다.
    5. 박테리아가 명확하게 보이는 수준으로 이미지의 위상 채널 대비를 조정합니다. 듀얼 채널 이미지를 열고 세그먼트 마스크 만들기 창을 시작하고 채널을 단계로 변경합니다.
    6. 개체 정의 단추를 사용 하 고 적절 한 임계값을 조정 하 고 작은 개체를 제거 합니다. 미세 조정 마스크에서 가장자리 오브젝트 제거를 선택하고 나중에 서로 인접한 박테리아 마스크를 분리합니다.
    7. 앞서 4.1.2-4.3 단계에서 설명한 바와 같이 각 셀에 대한 488 채널에서 신호의 극성 점수를 계산합니다.
  2. sfGFP 융합 단백질에 대한 역학정량화(그림 6)
    참고: 3절의 지침에 따라 이미지 수집을 위한 샘플을 준비합니다. 역학은 시간에 따른 강도의 변화로 정의되며 다음 단계는 짧은 이미징 기간(즉, 몇 분)을 위해 설계되었습니다. 더 긴 이미징 기간이 필요한 경우 패드에 적절한 보충제를 추가하십시오.
    1. 이미지 캡처 창에서 타임랩스를표시하고 간격 상자에 간격 시간을 입력하고 # 시간 포인트 상자에 2를 입력합니다. 관심 있는 형광 단백질을 발현하는 L. 폐렴구기의 2개의 연속적인 영상을 획득한다.
    2. 셀이 선명할 때까지 이미지 대비를 조정합니다. 그림 6A와 아래 설명을 따라 세 가지 다른 마스크를 배치합니다. 영역 도구를 사용하여 0.25 x 0.25 μm 정사각형을 400개 이상의 셀 중간에 배치합니다.
    3. 영역을 사용하여 마스크 단추를 사용하여 관심 있는 사각형의 마스크(마스크 1)를 만듭니다. 새 빈 마스크(마스크 2)를 만들고 픽셀 도구 또는 다각형 도구를 사용하여 형광 표백을 계산하는 데 사용되는 최소 25개의 임의 셀의 전체 셀 영역을 표시합니다. 새 빈 마스크(마스크 3)를 만들고 큰 브러시 도구를 사용하여 셀 사이의 영역을 표시하여 배경 빼기에 사용됩니다.
    4. 마스크 통계 및 마스크 범위에서마스크 1에 대한 개체를 선택하고 마스크 2를 선택합니다. 그런 다음 피처 및 강도아래에서 평균 강도를 선택하고 두 마스크의 데이터를 내보냅니다. 마스크 3의 경우 전체 마스크의 평균 강도를 내보냅니다.
    5. 다음 수식을 사용하여 마스크 1의 각 개체에 대한 형광 강도 변화를 계산합니다.

figure-protocol-5675

figure-protocol-5771

여기서 마스크1은 셀 중심에 배치된 0.25 μm×0.25 μm 정사각형이고, 마스크 2는 세포 들 사이의 배경이고, 마스크 3은 세포 들 사이의 배경이고, t1은 첫 번째 시점의 평균 강도이고, t2는 두 번째 시점의 평균 강도이다.

5. 저온 ET를 가진 sfGFP 질량 밀도의 검출

  1. 샘플 준비, 데이터 수집 및 재구성
    1. CYE-agar-streptomycin 플레이트에 형광 태그가 붙은 도트/Icm 단백질을 37°C에서 48시간 동안 발현하여 L. 폐렴구균의 무거운 패치를 성장시. ddH2O에서 OD600~0.7로 세포를 재중단한다. 콜로이드 금 입자 5 μL(BSA 트레이서, 10 nm)을 세포 현탁액의 20 μL에 추가합니다.
    2. 피펫 5 μL을 갓 광채배출된 홀리 카본 그리드(Cu 200 메쉬상에서 R2/1)에 놓고, 앞서설명한 바와같이 중력 구동 플런저 장치를 사용하여 필터 페이퍼로 블롯및 액체 에탄에 동결하여 1분 동안 방치한다.
    3. 300 kV 투과 전자 현미경으로 동결 수화 된 시편을 현장 방출 총, 에너지 필터, Volta 위상 플레이트 및 직접 검출 장치가 장착된 이미지. 단일 축 틸트 계열을 26,000x 및 42,000x 배율로 수집하여 표본 수준에서 각각 5.4 Å/픽셀 또는 3.4 Å/픽셀의 픽셀 크기를 생성합니다.
    4. 토모그래피 패키지 SerialEM을 사용하여 ~0 μm 디포커스에서 이미지 스택을 수집하고 3° 단계 증분 및 누적 용량으로 -60°에서 +60°의 기울기 각도를 사용하여 ~ 60 e - /Å2,16의누적 용량을 수집합니다. MotionCor217을사용하여 각 스택에서 용량 분별 된 영화 이미지를 정렬합니다. TOMOAUTO14를사용하여 드리프트 보정 스택을 조립합니다.
    5. IMOD 마커 종속 정렬18에의해 드리프트 보정 스택을 정렬합니다. 세분화 및 직접 이미지 분석 및 WBP방법(20)에대한 SIRT 방법19로 토모그램을 재구성합니다.
  2. sfGFP 융합 샘플의 서브토모그램 분석
    1. 소토모그램분석14,21,22에대한 토모그래피 패키지 I3 (0.9.3)을 사용합니다.
      참고: 각 반복은 참조 및 분류 마스크가 생성되고, 하위 토모그램이 정렬및 분류되고, 클래스 평균이 서로 정렬되는 세 부분으로 구성된 각 반복을 통해 반복적으로 진행됩니다.
    2. 초기 정렬을 위해 4 x 4 x 4 binned 하위 토모그램을 사용합니다. 클래스 평균에 속하는 입자를 병합하고 sfGFP에 해당하는 전자 밀도를 표시합니다. sfGFP 융합으로 입자를 정렬한 후, 관심 영역(예: 도트/Icm 세포질 ATPase 복합체)의 집중정렬을 위해 2 x 2 x 2 가닝 된 서브토모그램을 사용하여 고해상도 구조를 얻습니다.

결과

두 단계로 이중 선택과 상동성 재조합은 sfGFP의 정의된 삽입을 구성하는 데 사용되었다. 첫 번째 단계에서는 삼부모교교는, 대장균 조제균 MT616으로부터 pRK600 연상 플라스미드(IncP 플라스미드)를 두 개의 상동 부위에 의해 측면에 있는 sfGFP 유전자를 함유하는 자살 벡터 pSR47S를 가진 조균 균주 에게 동원된, 이식 오리의 기원과 바실러스의 기원을 수행하였다. 다음으로, p...

토론

세균 성 분 비 시스템의 기능을 해명 하는 호스트 병원 체 상호 작용의 완전 한 이해에 열쇠. 분비 시스템은 이펙터 단백질을 숙주 세포에 주입할 수 있는 복잡한 기계이며, 경우에 따라 세균 복제를 지원하는 세포내 틈새 시장 설립을 촉진합니다. 위의 방법은 호흡기 세균성 병원체 레지오넬라 폐렴구균의 도트 /Icm 분비 시스템을 연구하기위한 중요한 새로운 도구를 제공, 그 병원성에 필수...

공개

저자는 공개 할 것이 없다.

감사의 말

D.C. 및 C.R.R.은 NIH(R37AI041699 및 R21AI130671)에 의해 지원되었습니다. D.P., B.H., 및 J.L은 건강의 국가 학회에 의해 지원되었습니다 (R01AI087946 및 R01GM107629).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
10 nm colloidal gold particlesAurion25486
100x Plan Apo objective (1.4 NA)Nikon
ACESSigma-AldrichA9758
Activated charcoalSigma-AldrichC5510
Agaroze GPG/LMP, low meltAmerican bioanalyticalAB00981
Bacto dehydrated agarBD214010
CoolSNAP EZ 20 MHz digital monochrome cameraPhotometrics
Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 µLFisher ScientificAB-0578
Holey Carbon grid R 2/1 Cu 200 meshQuantifoilQ225-CR1
Iron(III) nitrate nonahydrateSigma-Aldrich216828
K2 Summit camera for cryo-EMGATAN
L-CysteineSigma-AldrichC7352
Microscope cover slides 22x22 mmFisher Scientific12-542B
Microscope cover slides 24x50 mmFisher Scientific12-545K
Microscope slides 25x75x1 mmGlobe Scientific1380
SlideBook 6.0Intelligent Imaging Innovations
Spectra X light engineLumencor
Taq 2X Master MixNew England BioLabsM0270
Titan KriosThermo Fisher Scientific
Yeast ExtractBD212750

참고문헌

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