대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

요약

박테리아는 생리 활성 생물학적 분자를 운반하는 나노 미터 크기의 세포 외 소포 (EV)를 분비합니다. EV 연구는 생물 발생, 미생물-미생물 및 숙주-미생물 상호 작용 및 질병에서의 역할, 잠재적 인 치료 응용 프로그램을 이해하는 데 중점을 둡니다. EV 연구의 표준화를 촉진하기 위해 다양한 박테리아로부터 EV를 확장 가능한 분리를 위한 워크플로우가 제시됩니다.

초록

다양한 박테리아 종은 지질, 단백질, 핵산, 글리칸 및 모 세포에서 파생된 기타 분자로 구성된 ~20-300nm의 세포외 소포(EV)를 분비합니다. EV는 종내 및 종간 통신 벡터로 기능하는 동시에 감염 및 식민지화의 맥락에서 박테리아와 숙주 유기체 간의 상호 작용에 기여합니다. 건강 및 질병에서 EV에 기인하는 다양한 기능을 감안할 때 체외 및 생체 내 연구를 위해 EV를 분리하는 데 대한 관심이 증가하고 있습니다. 물리적 특성, 즉 크기에 기반한 EV의 분리는 다양한 박테리아 배양에서 소포의 분리를 용이하게 할 것이라는 가설이 세워졌습니다.

분리 워크플로우는 박테리아 배양에서 EV를 분리하기 위한 원심분리, 여과, 한외여과 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 구성됩니다. 펌프 구동 접선 유동 여과(TFF) 단계를 통합하여 확장성을 향상시켜 시작 세포 배양 리터에서 물질을 분리할 수 있습니다. 대장균 은 EV 관련 나노루시퍼라제 및 비EV 관련 mCherry를 리포터 단백질로 발현하는 모델 시스템으로 사용되었습니다. 나노루시페라아제는 N-말단을 사이토리신 A와 융합하여 EV를 표적으로 삼았습니다. 관련 사이토리신 A-나노루크와 함께 20-100nm EV를 포함하는 초기 크로마토그래피 분획은 유리 단백질을 포함하는 후기 분획과 구별되었습니다. EV-관련 나노루시퍼라제의 존재는 면역금 표지 및 투과 전자 현미경에 의해 확인되었다. 이 EV 분리 워크플로우는 다른 인간 장 관련 그람 음성 및 그람 양성 박테리아 종에 적용할 수 있습니다. 결론적으로, 원심분리, 여과, 한외여과/TFF 및 SEC를 결합하면 다양한 박테리아 종에서 EV를 확장 가능한 분리할 수 있습니다. 표준화된 분리 워크플로우를 사용하면 종 간 미생물 EV의 비교 연구가 용이해질 것입니다.

서문

세포외 소포(EV)는 원핵 세포 및 진^{핵 세포 모두에서} 분비되는 지질, 단백질, 글리칸 및 핵산으로 구성된 나노미터 크기의 리포솜 유사 구조입니다1. 그람 음성 박테리아²에서 EV의 방출을 시각화하는 초기 연구 이후, 박테리아 EV (직경 20-300 nm)에 기인 한 생물학적 기능의 수는 지난 수십 년 동안 지속적으로 증가하고 있습니다. 이들의 기능에는 항생제 내성^전달3, 생물막 형성⁴, 쿼럼 감지⁵ 및 독소 전달⁶이 포함됩니다. 또한 박테리아 EV를 치료제로 사용하는 것, 특히 백신학⁷ 및 암 치료⁸에 대한 관심이 증가하고 있습니다.

EV 연구에 대한 관심이 높아지고 있음에도 불구하고 격리 방법에 대한 기술적 과제는 여전히 남아 있습니다. 특히, 재현 가능하고 확장 가능하며 다양한 EV 생산 유기체와 호환되는 분리 방법이 필요합니다. EV 분리 및 연구 방법을 계획하고 보고하기 위한 통일된 원칙을 만들....

프로토콜

알림: 박테리아 및 재조합 DNA와 관련된 모든 작업이 각 균주의 생물안전 위험 수준에 적합한 생물안전 억제를 위한 모범 사례를 따르는지 확인하십시오. 작업은 지역, 국가 및 국제 생물 안전 규정에 따라 수행되어야합니다.

1. 세균 균주 및 배양 조건

참고: 이 연구에 사용된 박테리아 균주는 대장균 MP1¹³, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium Breve 및 Bifidobacterium dentium이었습니다 .

1. 대장균의 경우 멸균 루프를 사용하여 단일 콜로니를 250-1,000mL의 Luria-Bertani(LB) 브로스에 접종하고 배양을 처리하기 전에 300rpm 및 37°C의 진탕 인큐베이터에서 48시간 동안 호기적으로 배양합니다. p114-mCherry-Clyluc(보충 방법 및 보충 그림 S1)이 있는 재조합 대장균 MP1 균주의 경....

결과

EV에 대해 어떤 SEC 크로마토그래피 분획이 농축되었는지 평가하기 위해 SEC 컬럼에 TFF에 의해 1,000배 농축된 대장균 MP1 조절 배양액 2mL를 로드하고 순차적 분획을 수집했습니다. MRPS를 사용하여 분획 1-6에 가장 많은 EV가 포함되어 있음을 알 수 있습니다(그림 2A). 후속 분획에는 EV가 없는 단백질 대신 포함된 EV가 거의 포함되어 있지 않았습니다(그림 2B

토론

위의 프로토콜에서는 확장 가능하고 다양한 그람 음성/양성 및 호기성/혐기성 박테리아로부터 EV를 안정적으로 분리하는 방법이 설명되어 있습니다. 절차 전반에 걸쳐 몇 가지 잠재적인 정지 지점이 있지만 컨디셔닝된 박테리아 배양 배지에서 EV를 분리하는 데 48시간 이상 걸리지 않는 것이 좋습니다.

첫째, 컨디셔닝 된 박테리아 배양 배지를 생성하기 위해 박테리아를 배양?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes	Thermo Scientific	3430	it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron microscopy sciences	15700
250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles	ThermoFisher	010-1495
500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles	ThermoFisher	010-1493
65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter	Beckman Coulter	392077	Allows Vivacell to fit in rotor
Akkermansia mucinophila	ATCC	BAA-835
Amicon-15 (100 kDa MWCO)	MilliporeSigma	UFC910024
Avanti J-20 XPI centrifuge	Beckman Coulter		No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482	ATCC	29148
Bifidobacterium breve	NCIMB	B8807
Bifidobacterium dentium	ATCC	27678
Brain Heart infusion (BHI) broth	Himedia	M2101	After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 µg/L), hematin (1.2 µg/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.
C-300 microfluidics cartridge	Spectradyne
Chloramphenicol	MP Biomedicals	ICN19032105
Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)	Takara	636763
Escherichia coli MP1	Dr. Mark Goulian (gift)		commensal bacteria derived from mouse gut
Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter	ThermoFisher	010-0151-05	used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture
Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor	ThermoFisher	F12-6x500-LEX	fits 6 x 500 mL bottles
Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper	Electron microscopy sciences	FCF-400-CU
Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)	Electron microscopy sciences	16100
Hematin	ChemCruz	207729B	Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as  1.2 mg/mL
Infinite M Nano+ Microplate reader	Tecan		This equibment was used to measure the mCherry fluorescence
In-Fusion  HD Cloning Plus	Takara	638909	For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors
JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	368690
Lauria Bertani (LB) broth, Miller	Difco	244620
L-Cysteine Hydrochloride	J.T. Baker	2071-05	It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK	cole-parmer - special	HV-30800-08	connection adapters for filtration tubing circuit
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK	cole-parmer - special	HV-30800-24	connection adapters for filtration tubing circuit
Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm	Masterflex	HV-07555-00
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor	Masterflex	EW-07514-10
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft	Cole Palmer	EW-06435-16	low-binding/low-leaching tubing
Menadione (Vitamin K3)	MP	102259	Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL
MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK	Repligen	D04-E100-05-N	TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant
Nano-Glo Luciferase Assay System	Promega	N1110	This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein
NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808	R&D Systems	MAB10026
nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument	Spectradyne
nCS1 Viewer	Spectradyne		Analysis software for particle size distribution
OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer	NEB	M0482	DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking
Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes	Eppendorf	30108450
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0492	DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning
qEV original, 35 nm	Izon		maximal loading volume of 0.5 mL
qEV rack	Izon		for use with the qEV-original SEC columns
qEV-2, 35 nm	Izon		maximal loading volume of 2 mL
Qubit fluorometer	ThermoFisher		Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)
Qubit protein assay kit	ThermoFisher	Q33211	Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 °C.
Sorvall Lynx 4000 centrifuge	ThermoFisher	75006580
SpectraMax i3x Microplate reader	Molecular Devices		This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence
Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL)	MilliporeSigma	S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE	One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.
Uranyl acetate	Electron microscopy sciences	22400
Vinyl anaerobic chamber	Coy Lab
Vivacell 100, 100,000 MWCO PES	Sartorius	VC1042
Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron)	MilliporeSigma	WHA68093002	to filter MRPS diluent