생체 내 온전한 등근 신경절에 있는 일차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징

요약

이 프로토콜은 후근 신경절(DRG)에 이어 GCaMP3(유전적으로 인코딩된^Ca2+ 지표; 녹색 형광 단백질-칼모듈린-M13 단백질 3) 동측 뒷발에 다양한 자극을 가하면서 Pirt-GCaMP3 마우스를 사용하여 신경 앙상블의^Ca2+ 이미징.

초록

Ca2+ 이미징은 세포질 내로의 Ca2+ 진입 또는 세포내^Ca2+ 저장소의 방출을 수반하는 활동 전위 및 다양한 신호전달 메카니즘을 포함하는 세포 활성에 대한 프록시로서 사용될 수 있다. 마우스에서 후근 신경절(DRG)의 일차 감각 뉴런의 Pirt-GCaMP3 기반^Ca2+ 이미징은 많은 수의 세포를 동시에 측정할 수 있는 이점을 제공합니다. 최대 1,800개의 뉴런을 모니터링할 수 있으므로 뉴런 네트워크와 체성 감각 과정을 생체 내 인구 수준에서 정상적인 생리학적 맥락에서 앙상블로 연구할 수 있습니다. 모니터링되는 많은 수의 뉴런을 통해 다른 방법을 사용하여 감지하기 어려운 활동 패턴을 감지할 수 있습니다. 자극은 마우스 뒷발에 적용될 수 있으며, DRG 뉴런 앙상블에 대한 자극의 직접적인 효과를 연구 할 수 있습니다. Ca 2+ 과도 현상을 생성하는 뉴런의 수 및 Ca²⁺ 과도 현상의 진폭은 특정 감각 양식에 대한 민감도를 나타낸다. 뉴런의 직경은 활성화된 섬유 유형(무독성 기계 대 유해 통증 섬유, Aβ, Aδ 및 C 섬유)의 증거를 제공합니다. 특정 수용체를 발현하는 뉴런은 Pirt-GCaMP와 함께 td-Tomato 및 특정 Cre 재조합 효소로 유전적으로 표지될 수 있습니다. 따라서 DRG의 Pirt-GCaMP3 Ca²⁺ 이미징은 통증, 가려움증, 촉각 및 기타 체성 감각 신호를 연구하기 위해 인구 수준에서 앙상블 역할을 하는 특정 감각 양식 및 뉴런 하위 유형을 분석하기 위한 강력한 도구와 모델을 제공합니다.

서문

일차 감각 뉴런은 피부를 직접 자극하고 체성 감각 정보를 중추 신경계로 다시 전달합니다 ^1,2. 등근 신경절(DRG)은 10,000-15,000개의 일차 감각 뉴런으로 구성된 세포체 클러스터입니다 ^3,4. DRG 뉴런은 다양한 크기, 수초화 수준, 유전자 및 수용체 발현 패턴을 나타냅니다. 더 작은 직경의 뉴런은 통증을 감지하는 뉴런을 포함하며, 더 큰 직경의 뉴런은 전형적으로 통증이 없는 기계적 자극에 반응한다 ^5,6. 손상, 만성 염증 및 말초 신경 병증과 같은 일차 감각 뉴런의 장애는 이러한 뉴런을 다양한 자극에 민감하게 만들고 만성 통증, 이질통 및 통증 과민증에 기여할 수 있습니다 ^7,8. 따라서 DRG 뉴런에 대한 연구는 일반적으로 체성 감각과 많은 통증 및 가려움 장애를 이해하는 데 중요합니다.

생체 내에서 발화하는 뉴런은 체성 감각에 필수적이지만, 최근까지 생체 내에서 온전한 신경절을 연구하는 도구는 상대적으로 적은 수의 세포로 제한되어 왔다⁹. 여기에서 우리는 생체 내 인구 수준에서 뉴런의 활동 전위 또는 활동을 앙상블로 연구하는 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 세포질^Ca2+ 역학에 기초한 이미징을 사용한다. Ca 2+ 민감성 형광 지시약은 일반적으로 낮은 농도의 세포질 Ca²⁺ 로 인해 세포 활성을 측정하기 위한 좋은 프록시입니다. 이 지표는 마우스 9,10,11,12,13,14,15,16 및 래트 ¹⁷에서 수백에서 수천 개의 일차 감각 뉴런을 동시에 모니터링 할 수있게 해주었습니다. 본 연구에 기술된 생체내 ^Ca2+ 이미징의 방법은 기계적, 저온, 열적 및 화학적 자극에 대한 집단 수준 반응을 직접 관찰하기 위해 사용될 수 있다.

포스포이노시티드-결합 막 단백질인 Pirt는 거의 모든(>95%) 일차 감각 뉴런(^18,19)에서 높은 수준으로 발현되며^, 생체 내에서 뉴런 활동을 모니터링하기 위해^Ca2+ 센서인 GCaMP3의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다(²⁰). 이 프로토콜에서, 공초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM)을 사용하여 Pirt-GCaMP3 마우스(¹⁴)의 우측 요추 5(L5) DRG에서 생체내 DRG 수술,^Ca2+ 이미징 및 분석을 수행하기 위한 기술이 기재되어 있다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 절차는 샌안토니오에 있는 텍사스 대학교 보건 과학 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

참고: 일단 시작되면 동물 수술(1단계)과 영상(2단계)을 연속적으로 완료해야 합니다. 데이터 분석(단계 3)은 추후 수행될 수 있다.

1. 우측 L5 DRG 이미징을 위한 수술 및 동물 고정

참고: 8주령 이상의 수컷과 암컷 Pirt-GCaMP3 C57BL/6J 마우스 모두 이 연구에 사용되었습니다. 성별 모두 동등하게 잘 이미지화 될 수 있지만, 어린 마우스에서 Pirt 발현이 약하거나 간헐적이기 때문에 마우스는 최소 8 주령이어야합니다. Pirt-GCaMP3 C57BL/6J 마우스는 존스 홉킨스 대학¹⁴에서 생성되었습니다. 어느 한 쪽의 DRG가 영상화될 수 있고, 다른 요추 DRG(예를 들어, 요추 4)가 영상화될 수 있다. 주어진 시간은 숙련 된 외과 의사에 대한 추정치입니다. 출혈 증가와 같은 간헐적인 기술적 문제로 인해 필요한 시간이 늘어날 수 있습니다.

1. 40mg/mL 케타민과 6mg/mL 자일라진을 함유한 멸균 식염수를 준비합니다. 총 부피는 영상 촬영 후 수술과 안락사 모두에 대해 체질량의 최소 9μL/g이어야 합니다.
   주의: 케타민은 주사하거나 삼키거나 눈에 들어갔을 때 유해합니다. 조심히 다루세요.
2. 모든 수술 도구가 고압증기멸균 또는 기타 NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에서 승인한 방법으로 깨끗하고 멸균되었는지 확인하십시오.
3. 수술 전 15분에서 25분 사이에 Pirt-GCaMP3 마우스에 체중 1g당 ~2.25μL의 케타민/자일라진(90mg/kg 케타민, 13.5mg/kg 자일라진)을 복강내(i.p.) 주사합니다. 케타민 120mg/kg을 초과하지 마십시오.
4. 마취 주사 후 15분에서 25분 이내에(1.3단계) 반대쪽 뒷발(동측/오른쪽 뒷발이 아님)을 꼬집어 마우스가 마취 수술면에 도달했는지 확인합니다. 뒷다리 금단 반사가 없으면 마취의 외과 적 평면이 달성됩니다.
   참고: 뒷다리 금단 반사는 마취를 모니터링하기 위해 실험 전반에 걸쳐 사용됩니다. 항상 반대쪽 뒷발을 사용하십시오.
5. 체온을 37°C로 유지하기 위해 가열된 패드에 마우스를 놓습니다.
   참고: 입체 프레임( 재료 표 참조) 또는 연구원의 선호도에 따라 다른 프레임으로 마우스의 머리를 제자리에 고정하는 것이 도움이 될 수 있습니다.
6. 마우스의 골반 뼈를 느끼면서 요추 비대를 찾습니다. 요추 확대 부위 위의 마우스 뒷면을 면도하십시오. 이 단계는 ~90초가 소요됩니다.
   알림: 면도를 위해 가열된 패드에서 마우스를 잠시 제거할 수 있습니다.
7. 가위를 사용하여 요추 확대 부위 위에 3면 직사각형 절개(8mm x 20mm)를 하고 집게로 피부를 접습니다(그림 1A). 이 단계는 ~2분 정도 걸립니다.
   참고: 연구원은 지혈 집게나 견인기를 사용하여 절개 부위를 열어 둘 수도 있습니다. 이것은 생존 수술이 아니므로 수술 부위를 추가로 청소할 필요가 없습니다. 그러나 포비돈 요오드를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 허용되는 가장 큰 절개 크기가 여기에 나와 있습니다. 큰 절개보다 작은 절개가 바람직합니다.
8. 13mm 스프링 해부 가위를 사용하여 척추 오른쪽에 3-4mm 절개를 만듭니다. 척추를 노출시키기 위해 가위를 사용하여 피부와 근육을 옆으로 자릅니다(그림 1B). 이 단계는 ~3분 정도 걸립니다.
9. 8mm 가위를 사용하여 출혈을 최소화하면서 근육과 결합 조직을 절단하여 오른쪽 L5 DRG의 횡돌기를 청소합니다. 면봉 및/또는 젤폼을 사용하여 혈액을 흡수하십시오. L5 척추는 골반 뼈의 첫 번째 척추 주둥이입니다.
   알림: 이 단계는 ~3분이 소요되며 동물이 평소보다 더 많이 피를 흘리면 추가 시간이 걸릴 수 있습니다.
10. Friedman-Pearson rongeurs 또는 강한 미세 집게를 사용하여 오른쪽 L5 횡단 프로세스를 잘라냅니다. DRG를 만지지 않도록 주의하십시오(그림 1C).
    알림: 이 단계는 ~2분이 소요되지만 동물이 정상보다 더 많이 피를 흘리면 추가 시간이 걸릴 수 있습니다.
11. 출혈이 완전히 멈출 때까지 진행하지 마십시오. 젤 폼이나 면을 사용하여 DRG 표면으로의 번짐을 방지하십시오. 이 단계는 1-4분 정도 걸립니다.
12. 마우스와 가열 패드를 사용자 지정 단계로 이동합니다.tage(그림 2A,B). 사용 stage, 테이프를 사용하여 동물과 가열 패드를 제자리에 고정합니다. 동물이 지속적인 이소 플루 란 마취를받을 수 있도록 동물의 코를 코 콘에 놓습니다. 자극이 발에 쉽게 적용될 수 있도록 오른쪽 뒷발을 무대에서 튀어 나와 고정하십시오. 이 단계는 3분 정도 걸립니다.
13. s로 척추를 제자리에 고정tage clamp척추 및/또는 L5 DRG의 주둥이와 꼬리에 있는 척추 및/또는 골반 뼈의 피부 위에. 클을 조정amps와 stageDRG의 표면을 가능한 한 평평하게 만듭니다(그림 2B,C).
    알림: DRG와 대물렌즈 사이에 있는 조직을 다듬어야 할 수도 있습니다.
14. d를 배치tage 현미경 아래로 낮췄을 때 대물렌즈가 DRG 바로 위에 8mm가 되도록 합니다(그림 3A,B). 직장 체온계를 삽입합니다.
    알림: DRG에서 대물렌즈까지의 거리는 대물렌즈, 현미경 및 동물에 따라 다를 수 있습니다.
15. 전원선을 가열 패드와 직장 체온계에 연결합니다. 노즈 콘을 이소플루란 가스 라인에 연결합니다.

그림 1: DRG 노출 수술의 예 . (A) 작은 부위를 면도하고 피부를 자르고 뒤로 접었습니다. 절개는 주둥이-꼬리 축에서 ~10mm입니다. (B) 척추의 오른쪽을 절개하고 근육과 결합 조직을 잘라내어 L5 오른쪽 횡돌기를 노출시켰습니다. 혈액은 젤폼으로 흡수되었다. (C) 횡돌기를 세척하고 DRG 위의 뼈를 제거했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: DRG 이미징을 위한 사용자 지정 단계에 마우스 장착 . (A) 사용자 지정 단계가 표시됩니다. 베이스 플레이트와 동물 용 플레이트로 구성됩니다. 동물 마운팅 플레이트는 잠금 볼과 소켓 스위블 조인트에 있습니다. 산소/이소플루란 혼합물을 전달하기 위한 라인이 있는 노즈 콘과 알루미늄 호일로 감싼 가열 패드와 함께 폐가스 라인이 동물 장착 플레이트에 테이프로 고정됩니다. 각각 3개의 잠금 볼과 소켓 스위블 조인트로 만들어진 2개의 암이 베이스 플레이트에 볼트로 고정됩니다. 각 팔에는 조이고 풀기위한 나사가있는 집게로 만든 클램프가 있습니다. (B) 동물은 동물 장착 플레이트에 장착됩니다. 코는 코 콘에 배치됩니다. 클램프는 척추와 골반 뼈를 고정하는 피부 위에 놓입니다. 오른쪽(동측) 뒷발은 자극을 가하기 위해 쉽게 접근할 수 있도록 튀어나오도록 테이프로 감겨 있습니다. (C) 클램핑된 척추와 골반뼈의 클로즈업 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 맞춤형 스테이지의 동물은 현미경 대물렌즈 아래에 배치됩니다 . (A) 무대, 동물 및 현미경의 광각 보기. DC 온도 컨트롤러에 대한 전선과 산소/이소플루란 흡입구 및 폐가스 라인에 대한 라인이 왼쪽에 표시됩니다. (B) 현미경 대물렌즈 아래 동물의 클로즈업 보기. DRG는 대물렌즈보다 ~8mm 아래에 있습니다. 직장 체온계가 삽입되고 코가 코 콘 안에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. DRG 이미징

1. 이미징을 위해 정립 컨포칼 현미경 10x/0.4 DIC 대물렌즈와 관련 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용합니다. 녹색 필터 (FITC) 설정을 사용하십시오 : 여기 495 nm, 방출 519 nm, 검출 파장 500-580 nm, GaAsP-Pmt1 이미징 장치, GaAsP-PMT 검출기.
   참고: 다른 현미경의 경우 제조업체의 권장 설정을 사용하십시오.
2. 현미경으로 DRG의 표면을 찾으십시오. CL을 조정ampDRG 표면이 가능한 한 평평하고 최대 표면적이 초점면에서 시각화되도록 s의 s.
   알림: 대물렌즈의 선택은 사용하는 현미경과 사용자 선호도에 따라 다를 수 있습니다. 소프트웨어 선택은 현미경에 따라 다릅니다. 레벨 DRG는 더 선명한 이미지를 생성하고, 소프트웨어가 더 선명한 동영상을 구성하고, 더 많은 뉴런을 이미징하고, 분석을 더 쉽고 정확하게 만듭니다.
3. 마우스가 마취된 상태를 유지하도록 노즈 콘에 산소 흐름의 1%-1.5% 이소플루란을 공급합니다. 과다 복용없이 이소 플루 란 마취를 유지하기 위해 절차 전반에 걸쳐 동물을주의 깊게 모니터링하십시오.
   참고: 마취를 유지하는 데 필요한 이소플루란의 양은 개별 동물 및 자극에 따라 다를 수 있습니다. 일반적으로 1.5%이면 충분합니다. 동물이 자극 중에 움직이면 이소 플루 란을 늘려야합니다. 호흡이 얕아지면 이소플루란을 줄여야 합니다. 각 자극 전에 반대쪽 뒷발에 뒷다리 철수 반사를 테스트하십시오.
   주의: 이소플루란은 흡입하면 해롭거나 현기증 또는 졸음을 유발할 수 있습니다. 흡입을 피하고 환기가 잘 되는 곳에서만 사용하십시오.
4. 현미경 신속 스캐닝 프로토콜을 로드합니다.
   1. 빠른 스캔을 위한 일반적인 설정 사용: 복셀 크기 2.496 μm x 2.496 μm x 16 μm, 512 x 512 픽셀, 10 광학 슬라이스 Z-스택, 1 에어리 유닛(AU)/32 μm, 1% 488 nm 레이저 출력 5 mW, 픽셀 시간 1.52 μs, 라인 타임 0.91 ms, 프레임 타임 465 ms, LSM 스캔 속도 8, 양방향 스캐닝, GaAsP-PMT 검출기 이득 650V, 디지털 이득 1. 최적의 설정은 현미경과 동물에 따라 다를 수 있습니다.
   2. 빠른 스캐닝 프로토콜을 설정하려면 획득 탭을 클릭합니다. Acquisition Parameters(수집 매개변수)에서 Frames(프레임 ) 탭을 클릭합니다. 512 x 512 사전 설정 > 클릭하여 512 픽셀 x 512 픽셀 이미지를 기록하도록 현미경을 설정합니다. 그러면 현미경 소프트웨어에 의해 결정되는 이미지 크기에 따라 복셀 크기의 X 및 Y 값이 설정됩니다.
   3. Acquisition Parameters(수집 매개변수)에서 Channels(채널) 탭을 클릭합니다. Track2 상자를 클릭합니다. Track2 상자 옆에 있는 드롭다운 메뉴를 사용하여 녹색(FITC)을 선택합니다. Track2 아래에 새 탭이 열립니다.
   4. 레이저 옆에 있는 488 상자를 클릭합니다. 이렇게 하면 여기 및 방출 파장이 설정됩니다.
   5. 488nm 슬라이더 옆에서 Laser Power를 1%로 설정합니다. 1 AU 버튼을 클릭하여 1 Airy 장치에 대한 aperature를 설정합니다. FITC에서 마스터 게인을 650V로, 디지털 오프셋을 0으로, 디지털 게인을 1로 설정합니다.
   6. 획득(Acquisition) 탭에서 Z-스택(Z-Stack) 상자를 선택합니다. 라이브 버튼을 클릭하면 신경절의 라이브 이미지를 볼 수 있습니다. 뉴런의 작은 호만 보일 때까지 초점면 손잡이를 위로 돌립니다.
   7. Acquisition Parameters(수집 매개변수)에서 Z-Stack(Z-Stack) 탭을 클릭한 > Set Last(마지막 설정) 버튼을 클릭합니다. 뉴런의 작은 호만 보일 때까지 초점면 노브를 아래로 돌립니다. Acquisition Parameters(수집 매개변수)에서 Z-Stack(Z-Stack) 탭을 클릭하고 Set First(첫 번째 설정) 버튼을 클릭합니다> 라이브 버튼을 클릭하여 라이브 이미지를 끕니다.
   8. Acquisition Parameters(수집 매개변수)에서 Z-Stack(Z-Stack) 탭을 클릭합니다. 슬라이스 필드를 10으로 채웁니다. 이렇게 하면 10개의 광학 슬라이스가 설정되고 복셀 깊이가 자동으로 결정됩니다.
   9. 획득(Acquisition) 탭에서 시계열 상자를 클릭합니다. Acquisition Parameters(수집 매개변수) 아래에 새로운 시계열 탭이 나타납니다. Time Series(시계열 ) 탭을 클릭하고 Cycles(주기) 필드를 클릭하여 다음에 수행하려는 주기 수를 확인합니다> 이 경우 8입니다.
   10. 스캔 속도와 방향을 설정합니다. Acquisition Parameters(획득 매개변수)에서 Acquisition Mode(획득 모드 ) 탭> > 양방향 스캔을 위한 Direction(방향 ) > Double Headed Arrow(양방향 화살표 )로 이동합니다. 획득 모드 탭을 선택하고 프레임 > 스캔 속도 슬라이더 > 8> 선택합니다.
       알림: 일반적으로 이전 실험의 설정을 로드할 수 있으며 이미지가 너무 밝거나 어두우면 레이저 출력을 조정하고 Z-Stack Set Last 및 Set First를 조정하기만 하면 됩니다.
5. 획득 탭에서 실험 시작을 클릭하여 DRG를 8주기로 짧게 스캔합니다. 시간이 지남에 따라 스캔의 직교 프로젝션(프레임당 한 번의 스캔)을 만들어 동영상을 만들고 DRG를 가로지르는 밝기의 "파동"과 같은 이미지 선명도 및 이미징 아티팩트를 수동으로 확인합니다. 클램프 위치와 광학 단면 두께를 조정하고 선명한 고품질 동영상이 나올 때까지 이 단계를 반복합니다.
   참고: 동물이 움직이거나 조사자가 움직이는 경우 이 단계를 반복해야 합니다. 찾아야 할 문제에는 실험 과정에서 점점 더 밝아지고 어두워지는 것처럼 보이는 신경절 영역(단일 뉴런뿐만 아니라)이 물결 모양으로 나타나거나 영역이 사라지거나 밝아지는 것이 포함됩니다. 작은 뉴런 직경(<20μm)의 약 절반 이상의 움직임은 또 다른 주요 문제입니다. 흔들림은 종종 Z-Stack의 첫 번째 위치와 마지막 위치를 더 가깝게 가져오고(위의 2.4.4 단계 참조) 광학 슬라이스 두께를 좁혀 고정할 수 있습니다. 동영상 1 은 수평을 맞추고 올바른 광학 슬라이스 두께를 설정하기 전에 물결 모양의 신경절의 예를 제공합니다. 동영상 2 는 레벨링과 광학 슬라이스 두께를 보정한 후입니다. 그 차이는 미묘하지만 분석에 엄청난 영향을 미칩니다.
6. 현미경 고해상도 스캐닝 프로토콜을 로드합니다.
   1. 고해상도 스캔을 위한 일반적인 설정 사용: 복셀 크기 1.248 μm x 1.248 μm x 14 μm, 1024 x 1024 픽셀, 6 광학 슬라이스 Z-스택, 1.2 airy unit (AU)/39 μm, 5% 488 nm 레이저 출력/25 mW, 픽셀 시간 2.06 μs, 라인 타임 4.95 ms, 프레임 타임 5.06 s, LSM 스캔 속도 6, 양방향 스캐닝, GaAsP-PMT 검출기 이득 650V, 디지털 이득 1. 최적의 설정은 현미경과 동물에 따라 다를 수 있습니다.
   2. 고해상도 스캐닝 프로토콜을 설정하려면 Acquisition 탭을 클릭합니다. Acquisition Parameters(수집 매개변수)에서 Frames(프레임 ) 탭을 클릭합니다. 1024 x 1024 > 사전 설정을 클릭하여 1024 픽셀 x 1024 픽셀 이미지를 기록하도록 현미경을 설정합니다. 그러면 현미경 소프트웨어에 의해 결정되는 이미지 크기에 따라 복셀 크기의 X 및 Y 값이 설정됩니다.
   3. Acquisition Parameters(수집 매개변수)에서 Channels(채널) 탭을 클릭합니다. Track2 상자를 클릭합니다. Track2 상자 옆에 있는 드롭다운 메뉴를 사용하여 녹색(FITC)을 선택합니다. Track2 아래에 새 탭이 열립니다.
   4. 레이저 옆에 있는 488 상자를 클릭합니다. 이렇게 하면 여기 및 방출 파장이 설정됩니다. 고강도 레이저 범위(High Intensity Laser Range ) 상자를 클릭합니다.
   5. 488nm 슬라이더 옆에서 Laser Power를 5%로 설정합니다. 1 AU 버튼을 클릭하여 1 Airy 장치에 대한 aperature를 설정합니다. FITC에서 마스터 게인을 650V로, 디지털 오프셋을 0으로, 디지털 게인을 1로 설정합니다.
   6. 획득(Acquisition) 탭에서 Z-스택(Z-Stack) 상자를 선택합니다. 라이브 버튼을 클릭하면 신경절의 라이브 이미지를 볼 수 있습니다. 뉴런의 작은 호만 보일 때까지 초점면 손잡이를 위로 돌립니다.
   7. Acquisition Parameters(수집 매개변수)에서 Z-Stack(Z-Stack) 탭을 클릭하고 Set Last(마지막 설정) 버튼을 클릭합니다>. 뉴런의 작은 호만 보일 때까지 초점면 노브를 아래로 돌립니다. Acquisition Parameters(수집 매개변수)에서 Z-Stack(Z-Stack) 탭을 클릭한 > Set First(첫 번째 설정) 버튼을 클릭합니다. 라이브 버튼을 클릭하여 라이브 이미지를 끕니다.
   8. Acquisition Parameters(수집 매개변수)에서 Z-Stack(Z-Stack) 탭을 클릭합니다. 슬라이스 필드를 6으로 채웁니다. 이렇게 하면 6개의 광학 슬라이스가 설정되고 복셀 깊이가 자동으로 결정됩니다.
   9. 획득(Acquisition) 탭에서 시계열 상자가 선택 취소되어 있는지 확인합니다(시계열 없음).
   10. 스캔 속도와 방향을 설정합니다. 획득 매개변수(Acquisition Parameters)에서 획득 모드(Acquisition Mode) 탭을 클릭하고 프레임 > 프리셋 > 1024 x 1024> 클릭합니다. 양방향 스캔을 >위해 획득 모드(Acquisition Mode) 탭을 프레임 > 방향(Frame Direction) > 양방향 스캔을 위해 선택합니다. 획득 모드 탭을 선택하고 프레임 > 스캔 속도 슬라이더 > 6> 선택합니다.
   11. 세포가 td-Tomato로 표지된 경우 녹색 채널 외에 적색 채널 592nm 여기/614nm 방출, 검출 파장 600-700nm를 스캔하도록 현미경을 설정합니다. Acquisition Parameters(수집 매개변수)로 이동하고 Track1 상자에 있는 Channels 탭을 클릭하여 설정합니다> Track1 상자 옆의 드롭다운 메뉴를 사용하여 빨간색(텍사스 빨간색)을 선택합니다. 488 상자 대신 561 상자를 클릭하는 것을 제외하고 2.6.3단계와 동일한 프로세스를 따릅니다. Laser Power(레이저 출력)를 1%로 설정합니다. Td-Tomato는 GCaMP3보다 훨씬 밝으며 더 낮은 레이저 출력이 필요합니다.
7. 획득(Acquisition) 탭 아래의 실험 시작(Start Experiment) 버튼을 클릭하여 DRG의 고해상도 이미지를 만듭니다.
8. 현미경 신속 스캐닝 프로토콜을 로드합니다(2.4단계 참조). 80주기(약 10분) 동안 DRG에서 자발적인 활동을 기록합니다. 직교 프로젝션 동영상을 생성하고 이미지 품질이 분석하기에 충분한지 확인합니다.
   참고: 품질 고려 사항은 2.5단계와 동일합니다.
9. 자극을 가하려면 현미경을 15-20 회 스캔하도록 설정하십시오. 기준선을 생성하기 위해 스캔 1-5가 완료될 때까지 기다립니다. 스캔 6-10 중에 자극을 적용하십시오. 둔감화를 방지하기 위해 다음 자극을 적용하기 전에 각 자극 후 최소 5분을 기다리십시오.
   알림: 기계적 자극을 먼저 가한 다음 차갑고 열적이며 화학적 자극을 가해야 합니다. 더 강한 자극(예: 더 높은 기계적 힘, 실온에서 더 먼 온도)보다 약한 자극(예: 낮은 기계적 힘, 실온에 가까운 온도)을 적용해야 합니다. 자극을 가할 때 DRG가 움직이지 않도록 하십시오. 특히 강한 열 자극의 경우 자극을 시작하기 전에 1-2분 동안 2% 이소플루란을 적용해야 하는 경우가 많습니다. 본 연구에 사용된 현미경에서는 각 스캔을 명확하게 들을 수 있어 연구자가 스캔의 끝을 쉽게 식별할 수 있어 스캔 후 즉시 자극을 적용할 수 있다 5. 그러나 일관된 시점에서 자극의 적용을 용이하게 하는 모든 방법이 효과가 있습니다.
10. 기계식 프레스의 경우 발을 건드리지 않고 패들 사이에 발로 알고미터의 집게를 잡고 스캔 5가 끝난 직후에 시작하여 스캔 10 직후에 핀치합니다. 알고리즘으로 가압력을 모니터링합니다( 재료 표 참조). 가압력을 원하는 힘에 최대한 가깝게 유지하고(여기서는 100g 프레스 자극을 사용함) 원하는 힘보다 10g을 초과하지 않도록 합니다.
    참고: 최소 0.07g의 von Frey 필라멘트와 최대 600g의 가압력으로 자극을 감지할 수 있습니다.
11. 차갑고 열 자극의 경우 물 비커를 원하는 온도보다 낮거나(저온의 경우) 이상(열의 경우)으로 식히거나 가열하고 스캔을 시작합니다. 여기서, 45°C 자극을 사용한다. 물이 올바른 온도일 때 스캔 5 직후 발을 물에 담가 자극을 가합니다. 스캔 10 직후 비커를 당겨 빼냅니다.
    알림: 온도는 스캔 1에서 원하는 온도의 5°C 이내여야 합니다. 비커 온도가 올바르지 않으면 뉴런을 둔감하게 만들 수 있으므로 자극을 가하지 마십시오. 대신 물을 다시 식히거나 다시 데우고 다시 시도하십시오. 최저 0°C(얼음물)에서 최고 95°C의 온도를 측정했습니다. 그러나 50 °C 이상의 온도는 조직을 손상시키고 이후 실험을 혼란스럽게 할 수 있음을 기억하십시오. 유사하게, 일부 화학 물질(예: 테트로도톡신, 캡사이신)은 돌이킬 수 없거나 씻어낼 수 없으며 동물에 대한 추가 실험을 방해할 수 있습니다.
12. 모든 자극을 적용하고 기록한 후 케타민/자일라진(200mg/kg 케타민, 30mg/kg 자일라진 또는 1.1단계에서 제조한 용액 g당 5μL)을 과다 투여한 후 참수하여 동물을 안락사시킵니다.

3. 데이터 분석

1. ImageJ로 끌어다 놓아 이미지 파일을 엽니다. 파일을 연 후 이미지 > 유형 > RGB 색상에서 이미지 유형을 선택합니다.
   참고: StackReg의 플러그인 아래에 있는 StackReg²¹ 플러그인> 이동 아티팩트를 수정하고 정렬하는 데 유용합니다. ImageJ는 대부분의 현미경 소프트웨어 파일 형식을 읽을 수 있습니다. 이미지 유형의 선택은 사용자 기본 설정에 따라 다릅니다. RGB는 게시용 컬러 이미지 생성을 단순화합니다. 현미경 제조업체 또는 cytoNet²²의 소프트웨어 패키지도 분석에 도움이 될 수 있습니다. StackReg를 다운로드, 설치 및 사용할 필요는 없지만 권장됩니다.
2. 관심 영역(ROI) 도구를 사용하여 분석 > 도구 > ROI 관리자에서 활성 뉴런을 선택합니다. 도구 모음의 타원 또는 직사각형 도구를 사용하여 ROI를 그리고 ROI 관리자 창의 추가 아래에 있는 추가 버튼을 누르거나 "t" 키를 눌러 ROI 파일에 배치합니다.
   참고: ROI 파일을 자주 저장해야 합니다. 사용자는 ROI 파일을 ImageJ로 드래그 앤 드롭하고 ROI 관리자 창 하단의 모두 표시 상자를 클릭하여 언제든지 ROI를 복원할 수 있습니다. 오버레이로 저장하는 것은 권장되지 않습니다. 경험에 비추어 볼 때 ROI.zip 파일로 저장하면 분석이 간소화됩니다.
3. Analyze > Set Measurements(측정 분석 설정)에서 mean gray value(평균 회색 값) 옵션이 선택되어 있는지 확인합니다. Set Measurements(측정 설정)에서 다른 모든 확인란의 선택을 취소합니다. ROI 관리자 메뉴의 다중 측정 도구를 사용하여 ROI 내의 강도를 계산합니다. More > Multimeasure(다중 측정)에서 ROI 창을 사용하여 강도를 측정합니다.
   참고: 때로는 인접한 뉴런이 너무 가까워서 별도의 ROI를 그릴 수 없습니다. 이 뉴런은 일시적인 강도를 측정하는 데 사용할 수 없지만 활성화 뉴런 수에 포함될 수 있습니다.
4. Multimeasure에서 생성된 CSV 파일을 저장하고 스프레드시트 소프트웨어로 CSV 파일을 엽니다.
   참고: 보충 파일을 참조하십시오 1 분석에 도움이 되는 예제 스프레드시트 템플릿입니다.
5. Ca2+ 과도 강도를 ΔF/F0 = (Ft-F0)/F0로 계산하고, 여기서_Ft는 관심 시점에서의 ROI에서의 픽셀 강도이고, _F0는 자발적 활동에 대한 Ca2+ 과도기 이전의 2-4 프레임 또는 ^Ca2+에 대한 ROI의 처음 1-5 프레임의 강도를 평균함으로써 결정된 기준선 강도이다 자극 중에 발생하는 과도 현상. 자극 전에^Ca2+ 피크를 생성하는 뉴런을 제외하고, 자극이 끝난 후에는 활성을 분석하지 않습니다.
6. Ca²⁺ 과도 강도 분석의 경우, 가장 많은 수의 반응 뉴런을 생성한 신경절로 데이터가 왜곡되지 않도록 각 신경절에서 거의 동일한 수의 뉴런을 무작위로 샘플링합니다. ΔF/_F0 < 0.15인 피크는 제외한다.
   참고: 뉴런 11,12,23,24,25,26,27,28의 분석 및 포함/제외에 대해 발표된 대체 방법이 있습니다.
7. ImageJ의 도구 모음에 있는 선 도구를 사용하여 뉴런 직경을 측정합니다. 가장 긴 지름과 가장 짧은 지름을 따라 그려진 선에서 평균 지름을 계산합니다.

결과

그림 4: Pirt-GCaMP3 마우스의 L5 등쪽 뿌리 신경절의 대표 이미지. (A,D) Pirt-GCaMP3 마우스의 L5 등쪽 뿌리 신경절의 단일 프레임 고해상도 스캔이 표시됩니다. (비,이) . 자극이 없는 경우 패널 A와 패널 D에서 각각 Pirt-GCaMP3 L5 DRG 신경절?...

토론

지속적인 통증은 다양한 장애에 나타나며, 약 8%의 사람들의 삶의 질을 쇠약하게 하거나 감소시킨다²⁹. 일차 감각 뉴런은 피부의 유해한 자극을 감지하며, 그 가소성은 지속적인 통증에 기여합니다⁸. 뉴런은 세포 배양 및 외식편에서 연구할 수 있지만 그렇게 하면 정상적인 생리학적 맥락에서 제거됩니다. DRG의 외과적 노출에 이어 Pirt-GCaMP3 Ca²⁺ 이미징을 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anased Injection (Xylazine)	Covetrus, Akorn	33197
C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC	Cal Zeiss	422642-9900-000
Cotton Tipped Applicators	McKesson	24-106-1S
Curved Hemostat	Fine Science Tools	13007-12
DC Temperature Controller	FHC	40-90-8D
DC Temperature Controller Heating Pad	FHC	40-90-2-05
Dumont Ceramic Coated Forceps	Fine Science Tools	11252-50
FHC DC Temperature Controller	FHC	40-90-8D
Fluriso (Isoflurane)	MWI Animal Health, Piramal Group	501017
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16221-14
GelFoam	Pfizer	09-0353-01
Ketaset (Ketamine)	Zoetis	KET-00002R2
Luminescent Green Stage Tape	JSITON/ Amazon	B803YW8ZWL
Matrx VIP 3000 Isoflurane Vaporizer	Midmark	91305430
Micro dissecting scissors	Roboz	RS-5882
Micro dissecting spring scissors	Fine Science Tools	15023-10
Micro dissecting spring scissors	Roboz	RS-5677
Mini Rectal Thermistor Probe	FHC	40-90-5D-02
Operating scissors	Roboz	RS-6812
Pirt-GCaMP3 C57BL/6J mice	Johns Hopkins University	N/A	Either sex can be imaged equally well. Mice should be at least 8 weeks old due to weak or intermittent Pirt promoter expression in younger mice.
SMALGO small animal algometer	Bioseb In vivo Research Instruments	BIO-SMALGO
Stereotaxic frame	Kopf Model 923-B	923-B
td-Tomato C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	7909
Top Plate, 6 in x 10 in	Newport	290-TP
TrpV1-Cre C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	17769
Zeiss LSM 800 confocal microscope	Cal Zeiss	LSM800
Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Software	Cal Zeiss	Zen (Blue Edition) 2.6