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Method Article
우리는 cell-free 합성 생물학의 원리와 인간 및 동물 혈청에서 항체 반응의 맞춤형 검출을 위한 dot-blot 기술을 기반으로 최근에 개발된 면역분석 플랫폼에 대해 설명합니다.
지난 20년 동안 전 세계적으로 잇따른 병원성 발병은 혈청감시 전략의 중요성을 강조했습니다. 환자의 혈청에서 질병 특이적 항체를 검출하는 역할을 하는 면역분석 플랫폼은 혈청감시의 핵심입니다. 일반적인 예로는 효소 결합 면역흡착 분석법 및 측방 유동 분석이 있습니다. 그러나 이러한 방법은 황금 표준 방법이지만 병원체 전용 소모품과 특수 장비가 필요하므로 자원이 풍부한 실험실 밖에서는 사용이 제한됩니다.
당사는 최근 CFDB(Cell-Free Dot-Blot)라는 새로운 면역분석 플랫폼을 개발하여 SARS-CoV-2에 대해 인간 및 동물 혈청을 사용하여 검증했습니다. 기존의 면역 분석법과 달리 CFDB 환자 혈청 샘플은 고체상(니트로셀룰로오스 멤브레인)에 고정되는 반면 표적 항원은 분석의 이동상에 부유합니다. 혈청감시 기능에 대한 접근성을 개선하기 위해 CFDB 항원은 체외 단백질 발현을 사용하여 저부하 인프라로 주문형으로 생산됩니다. 여기서 항원은 모든 CFDB 분석을 위해 단일 범용 리포터 단백질을 사용하여 검출할 수 있는 펩타이드 태그와 융합됩니다. 그 결과 CFDB는 다중 웰 플레이트 리더 또는 정제된 상용 분자 분석 구성 요소에 대한 액세스를 요구하지 않습니다. 이러한 설계 고려 사항을 통해 CFDB는 비중앙 집중식 실험실에 대한 접근성, 신종 병원체에 대한 적응성 및 저소득 커뮤니티에 대한 경제성을 제공함으로써 기존 면역분석 플랫폼의 단점을 해결합니다.
현재 기사에서는 CFDB 면역분석을 준비하고 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다. SARS-CoV-2 CFDB에 대한 최근 연구를 예로 들어 주문형 무세포 생산을 위한 항원 DNA 설계, CFDB 리포터 단백질 준비, 고체상에서 혈청 샘플의 고정화, 마지막으로 분석의 항원 결합 및 검출 단계를 다룰 것입니다. 우리는 이러한 지침을 따름으로써 연구자들이 CFDB 분석을 조정하여 주어진 병원체에 대한 인간 및 동물 혈청의 면역 반응을 검출할 수 있을 것으로 기대합니다.
COVID-19 팬데믹으로 인해 특히 리소스가 부족한 환경에서 저렴하고 확장 가능한 진단 도구에 대한 필요성이 절실히 드러났습니다1. 효소결합 면역흡착 분석법(ELISAs)과 같은 기존 면역분석법은 면역 반응을 검출하는 데 필수적인 것으로 입증되었습니다 2,3. 그러나 높은 비용, 복잡한 시약에 대한 의존도, 특수 장비에 대한 의존성으로 인해 특히 글로벌 보건 위기 시에는 접근성이 제한됩니다. 이러한 문제에 대응하기 위해 당사는 인간 및 동물 혈청에서 항-SARS-CoV-2 항체를 검출하도록 설계된 저비용의 적응형 면역분석 플랫폼인 CFDB(Cell-Free Dot Blot)를 개발했습니다.
CFDB는 선형 DNA 템플릿 4,5를 사용하여 바이러스 항원의 신속한 주문형 생산을 위해 cell-free 합성 생물학을 활용합니다. 이를 통해 기존의 세포 기반 클로닝, 발현 및 정제 공정의 필요성을 없애 항원 생산 속도를 크게 높이는 동시에 비용을 절감할 수 있습니다. CFDB 방법은 혈청이 니트로셀룰로오스 멤브레인에 직접 발견되는 도트 블롯 형식을 사용하여 항체 검출을 단순화합니다. 이 시스템은 값비싼 멀티웰 플레이트와 특수 실험실 장비의 필요성을 없애주어 배양 및 세척 단계를 위한 간단한 "디핑" 워크플로우를 가능하게 합니다. 이 플랫폼은 또한 SpyCatcher2-Apex2 peroxidase 키메라가 범용 2차 검출 시약 5,6으로 작용하는 SpyCatcher-SpyTag 시스템을 활용합니다. 이는 표준 Escherichia coli 기반 발현을 사용하여 생산되며, 이는 값비싼 상용 항체 접합체에 대한 의존성을 제거합니다. 그 결과, CFDB 시스템은 상용 ELISA 키트의 경우 미화 300달러가 넘는 것에 비해 96개 시료 분석당 약 3달러라는 훨씬 저렴한 비용으로 ELISA와 비슷한 성능으로 혈청학적 분석을 수행할 수 있습니다5.
CFDB의 효과를 입증하기 위해 사전 특성화된 인간 및 동물 혈청에서 항체를 검출하는 능력을 테스트했습니다. 우리의 결과는 COVID-19 양성 및 음성 샘플을 식별하는 데 있어 ELISA와 밀접한 상관관계가 있었습니다. 인체 진단 외에도 SARS-CoV-2에 감염된 햄스터와 재조합 뉴클레오캡시드 단백질로 백신을 접종한 햄스터의 혈청을 테스트하여 동물 모델에서 CFDB의 유용성을 평가했습니다. 이 테스트를 통해 CFDB가 인간 및 수의학 진단에 모두 사용할 수 있는 잠재력을 확인했으며, 이는 CFDB가 종 간의 면역 반응을 모니터링하기 위한 다목적 도구가 되었습니다. CFDB의 주요 장점 중 하나는 유연성입니다. 관심 항원을 인코딩하는 DNA 템플릿을 수정하기만 하면 플랫폼을 빠르게 조정하여 다양한 병원체에 대한 항체를 검출할 수 있으므로 향후 팬데믹 대비에 유용합니다. 저렴한 비용, 간단한 워크플로우 및 최소한의 인프라 요구 사항으로 인해 상용 진단에 대한 접근이 제한된 분산된 실험실 및 리소스가 적은 환경에 특히 적합합니다.
이 작업에서는 CFDB 분석을 준비하고 수행하기 위한 단계별 지침을 제공합니다. 먼저, 분석의 주요 검출 시약인 항원의 무세포 생산을 위한 선형 DNA 템플릿의 설계 및 합성을 다룹니다. 그런 다음 분석의 2차 검출 시약인 SpyCatcher2-Apex2의 준비 단계를 설명합니다. 그 후, 무세포 생산 및 항원 자체의 품질 검사에 대한 지침을 제공합니다. 마지막으로, 인간 또는 동물 혈청 샘플에 대한 CFDB 분석을 수행하는 프로세스를 자세히 설명합니다.
모든 햄스터 실험은 캐나다 공중 보건국의 국립 미생물학 연구소(NML)에서 수행되었으며, 캐나다 인간 및 동물 건강 과학 센터의 승인을 받았으며 캐나다 동물 관리 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 인간 혈청/혈장 샘플은 사내 테스트를 위해 상업적으로 획득하거나 NML에서 독립적인 테스트를 위해 임상 협력자가 NML에 제공했습니다.
1. 항원 선형 발현 템플릿(LET)의 설계 및 준비
그림 1: SARS-CoV-2-NP에 대한 선형 발현 템플릿. His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP 선형 DNA 템플릿의 특징을 나타내는 회로도. 주요 DNA 템플릿 요소에 라벨이 부착되어 있습니다. 관심 단백질(여기서는 NP)에 대한 암호화 서열은 효율적인 발현을 위해 T7 promoter의 transcriptional control 하에 배치됩니다. N-말단에서 NP 단백질에는 SpyCatcher2-Apex2 검출 시약을 사용하여 특이적 검출을 위한 SpyTag가 추가됩니다. x6His-tag 및 TEV 프로테아제 사이트는 일반 LET 설계의 일부로 포함되지만 CFDB 목적에는 필수적입니다. 선형 DNA 주형의 말단에서, 각각 50개의 염기쌍 완충액 서열이 선행하는 "업스트림(upstream)" 및 "다운스트림(downstream)" Ter 부위가 cell-free lysate에서 exonucleolytic DNA degradation에 대한 Tus 매개 보호를 위해 포함됩니다. 약어: NP = 뉴클레오캡시드 단백질; LET = 선형 표현식 템플릿; TEV = 담배 에칭 바이러스; CFDB = cell-free 점 블롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. SpyCatcher2-Apex2 리포터 단백질의 정제
3. Cell-free 생산 및 항원의 품질 검사
4. 혈청 샘플
5. CFDB(Cell-free Dot Blot) 절차
그림 2: CFDB 어셈블리. CFDB 마스터 그리드 및 NC 멤브레인 어셈블리 설정의 회로도입니다. 마스터 그리드는 NC 멤브레인에 오버레이되어 혈청 샘플의 스포팅 및 고정을 위한 규칙적이고 주소 지정 가능한 패턴을 제공합니다. 약어: CFDB = cell-free dot blot; NC = 니트로셀룰로오스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: CFDB 워크플로우의 개략도 . CFDB 분석에서는 소량(<0.4 μL)의 10x 희석 혈청 샘플을 주소 지정 가능한 개별 위치(중간 패널)의 미리 절단된 니트로셀룰로오스 멤브레인(왼쪽 패널)에 수동으로 분주합니다. 3중 반점에 반점당 하나의 혈청 샘플을 증착하고 혈청의 총 항체 저장소를 포함한 단백질 함량을 고체 NC 기질(중간 패널의 베이지색 반점)에 고정시킵니다. 이 예시에서, 혈청 샘플에 포함된 항-NP 항체는 먼저 CFDB 1차 검출 시약 SpyTag-NP에 의해 결합될 수 있으며, 최종적으로 CFDB 2차 검출 시약 SpyCatcher2-Apex2(오른쪽 패널 확대 버블)에 의해 검출될 수 있습니다. 이 그림은 Norouzi et al.5에서 발췌한 것입니다. 약어: CFDB = cell-free dot blot; NP = 뉴클레오캡시드 단백질; LET = 선형 표현식 템플릿. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표적 항원에 대한 선형 발현 템플릿의 PCR 증폭
SARS-CoV-2 NP LET를 PCR 증폭하기 위해 프로토콜 섹션 1.2에 설명된 대로 범용 Ter 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하고 PCR 산물의 정제를 진행하기 전에 아가로스 겔(그림 4)에서 제품의 1μL를 확인했습니다.
COVID-19는 감염 발생을 통제하고 글로벌 보건 전략을 최적화하기 위해 접근 가능하고 강력한 진단의 중요성을 강조했습니다. 보호 항체를 검출하는 혈청학적 검사는 새로운 변이의 전염 패턴을 추적하고, 핫스팟을 식별하고, 백신 개발을 안내하고, 의심 사례를 분류하고, 취약 인구를 보호하는 데 필수적인 것으로 입증되었다14. 팬데믹은 또한 접근성 테?...
M.N.과 K.P.는 cell-free dot blot 방법의 공동 발명자입니다. 본 작품에 관한 가특허출원이 개시되었습니다(PCT/CA2024/050097, 2024년 1월 출원).
S.S.와 R.Z.는 미국 국방고등연구계획국(DARPA)의 자금 지원을 받고 있으며, 계약 번호는 N66001-23-2-4042입니다. 표현된 견해, 의견 및/또는 조사 결과는 저자의 견해이며 국방부 또는 미국 정부의 공식 견해나 정책을 나타내는 것으로 해석되어서는 안 됩니다. 이 작업은 CIHR 재단 보조금 프로그램(201610FDN-375469), CIHR 캐나다 연구 의장 프로그램(950-231075 및 950-233107), 캐나다 최초 연구 우수성 기금(Canada First Research Excellence Fund)에서 자금을 지원받고 캐나다 국방 연구 개발부의 캐나다 안전 및 보안 프로그램(계약 39903-200137)에서 K.P.에 자금을 지원하는 토론토 대학의 의학 디자인 이니셔티브(Medicine by Design Initiative)에서 K.P.에 대한 자금으로 지원되었습니다. 그림 1 및 보충 그림 S1 은 SnapGene Viewer를 사용하여 생성되었습니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 kb DNA ladder | NEB | N3232 | Used as a size marker for agarose gels |
20 Amino acids | Sigma-Aldrich | LAA21-1KT | A component of the cell-free reaction Solution B |
2 mm biopsy punch | Integra Miltex | 33-31-P/25 | For preparation of CFDB master grid |
5-aminolevulinic acid hydrochloride | Sigma-Aldrich | A3785 | Heme precursor for induction of SpyCatcher2-Apex2 |
Agarose powder | BioShop | AGA002 | For electrophoretic analysis of DNA |
Anti-SARS-CoV2-Nucleocapsid antibody | Sinobiological | 40588-T62 | For WB detection of cell-free produced NP antigen |
Bio-Rad ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | N/A | Gel imager instrument |
Centrifugal concentrators | Cytiva | 28-9323-60 | For concentration and buffer exchange of proteins |
Centrifuge | Eppendorf | EP022628257 | For harvesting bacterial culture |
Coenzyme A sodium salt hydrate (CoA) | Sigma-Aldrich | C3144 | A component of the cell-free reaction Solution A |
Color pre-stained protein standard (broad range) | NEB | P7719 | Used as a size marker for SDS-PAGE gels |
Covid-19 serum panel | RayBiotech | CoV-PosSet | Pre-characterised sera for verification and optimisation of CFDB reagents/conditions |
D-(−)-3-Phosphoglyceric acid disodium salt (3-PGA) | Sigma-Aldrich | P8877 | A component of the cell-free reaction Solution B |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Component of buffers |
E. coli 5-alpha | NEB | C2987 | for plasmid preparation |
E. coli BL21 | NEB | C2530 | For preparation of cell-free lysates |
E. coli BL21 (DE3) | NEB | C2527 | For expression of SpyCatcher2-Apex2 |
EDTA-free protease inhibitor tablet | Sigma-Aldrich | 11836153001 | A component of E. coli lysis buffer |
Eppendorf New Brunswick Innova 43/43R Incubator Shaker | Eppendorf | EPM1320 | Incubator for growing E. coli cells for protein expression and cell-free lysate preparation |
Folinic acid | Sigma-Aldrich | 47612 | A component of the cell-free reaction Solution A |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | Component of SpyCatcher2-Apex2 storage buffer |
Hemin chloride | Sigma-Aldrich | H9039 | For Heme supplementation of SpyCatcher2-Apex2 |
Hydrogen peroxide 30% | Sigma-Aldrich | H1009 | For making ECL reagent |
Image Lab Software | Bio-Rad | 1709690 | Software for ChemiDoc gel imaging instrument |
Isopropyl-b-D-1-thiogalactopyranoside | Bioshop | IPT001 | For induction of SpyCatcher2-Apex2 expressikon |
Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | For preparation of SpyCatcher2-Apex2 bacterial culture |
LB agar | BioShop | LBL406 | For E. coli growth |
LB broth | BioShop | LBL407 | For E. coli growth |
luminol | Sigma-Aldrich | A4685 | For making ECL reagent |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | For lysis of bacterial cells |
Magnesium Acetate | Sigma-Aldrich | M5661 | A component of the cell-free reaction Solution B |
NEBExpress Ni resin | NEB | S1428S | For purification of SpyCatcher2-Apex2 |
Non-fat dry milk | Bioshop | SKI400 | For blocking of WB and CFDB membranes |
Parafilm | Bemis | 2099-1337410 | For ECL-incubation of CFDB blots |
p-coumaric acid | Sigma-Aldrich | C9008 | For making ECL reagent |
pET24b-SpyCatcher2-Apex2 plasmid | Pardee Laboratory | N/A | Used for the expression of SpyCatcher2-Apex2 protein |
Petri dish | Fisherbrand | FB0875712 | Container for WB and CFDB membrane incubation |
Phosphate buffered saline 10% | BioShop | PBS405 | Component of buffers |
Potassium Glutamate | Sigma-Aldrich | G1501 | A component of the cell-free reaction Solution B |
Potassium Oxalate Monohydrate (Oxalic acid) | Sigma-Aldrich | 223425 | A component of the cell-free reaction Solution A |
Precast SDS-PAGE gel | BioRad | 4561036EDU | For electrophoretic analysis of protein |
Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491 | For PCR amplification of LETs |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28106 | For purification of LETs |
Ribonucleotide Solution Set | NEB | N0450S | A component of the cell-free reaction Solution A |
Skim milk powder | BioShop | SKI400 | Used as a blocking agent for western blot and CFDB |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | A component of protein purification buffers |
Sonicator | Qsonica | Q500 | For lysis of bacterial cells |
Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | A component of the cell-free reaction Solution A |
Syringe filter | Sigma-Aldrich | SLGSR33SS | For sterilisation of buffers and solutions |
Thermocycler | BioRad | T100 | Instrument for incubating PCR reactions |
Transfer RNA (tRNA) | Sigma-Aldrich | R8759 | A component of the cell-free reaction Solution A |
Tris buffered saline | Thermo Scientific | J60764.K2 | Component of WB and CFDB wash buffer |
Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | For making tris buffer |
Tunair SS-5012 Half-Baffle Shake Flask, 2.5 L | Cole-Parmer | RK-01835-39 | Vessel for growing E. coli cells for protein expression and cell-free lysate preparation |
Tween-20 | BioShop | TWN510 | Component of WB and CFDB wash buffer |
Tweezer | Almedic | 7728-A10-100 | For handling CFDB NC membrane |
UV-Vis spectrophotometer | Thermo Scientific | 13400518 | Used for the measurement of nucleic acid and DNA concentration and bacterial culture OD |
WHO International Reference Panel for anti-SARS-CoV-2 immunoglubulin | NISBC | 20/268 | Pre-characterised sera for verification and optimisation of CFDB reagents/conditions |
β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate (NAD) | Sigma-Aldrich | 10127965001 | A component of the cell-free reaction Solution A |
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