1. 동물을 페어링할 때 필요한 정보에는 적절한 명명법, 육종가 남성과 여성의 생년월일 및 설정 날짜를 활용하는 동물의 변형/재고가 포함됩니다. 정확한 기록 보관은 식민지 를 사육하는 데 필수적입니다.
2. 쥐와 쥐의 성 결정은 무귀생식 거리를 비교하여 수행됩니다. 여성의 경우 항문과 외부 생식기 사이의 거리가 남성보다 짧습니다. 남성 동물에 음낭의 존재는 또 다른 섹스 지표.
3. 짝짓기 구성표 선택 및 설정
참고: 사용할 수 있는 두 개의 짝짓기 체계가 있습니다.
- Proestrus/estrus 시간 제짓 짝짓기: 이 방법은 최대 수용성과 다산의 시점에서 남성과 여성을 paring에 의존합니다.
- estrous 주기는 proestrus와 estrous의 표시 되는 변화에 대 한 외부 생식기의 시각적 검사에 의해 또는 질 분비물의 세포학에 의해 여성에서 모니터링 해야 합니다 (아래 참조).
- 여성이 프로스트루스 나 에스트러스에 있다고 결정되면, 동물은 일반적으로 밤에 짝을 이루는 것처럼 하루가 끝날 때 남성과 짝을 이룹니다.
- 다음 날 아침, 여성은 코큘라플러그검사를 받는다(아래 참조). 플러그가 없는 경우, 여성은 하루 동안 남성과 함께 남아 하루의 끝에 copulatory 플러그를 검사 할 수 있습니다. 또는, 그녀가 더 이상 프로스트루스 또는 에스트루스에 없는 것으로 판명되면, 그녀는 번식 케이지에서 제거됩니다.
- 랜덤 시간 단축 결합: 이 방법은 설치류의 estrous 주기가 매우 짧고 4-5 일 길이라는 사실을 기반으로합니다.
- 이 방법의 경우, 짝짓기는 언제든지 설정할 수 있으며, 여성은 플러그가 관찰 될 때까지 매일 아침저녁과 저녁에 copulatory 플러그를 검사합니다.
- 여성은 저녁에 남성과 짝을 이룹니다.
- 플러그가 관찰될 때까지 매일 시작과 끝에 코뮬레이트 플러그를 검사합니다. 이 방법을 사용할 때 플러그를 볼 수 있는 데 일반적으로 3일 이상이 걸립니다.
4. 임신 예측
새끼의 심푸는 임신 도중 나중에까지 어렵기 때문에, 약 10-12, 설치류를 위한 상업적인 초음파 시스템이 개발되었습니다; 그러나, 몇몇 동물 연구 시설은 이 기술을 가지고 있습니다. 따라서, copulatory 플러그의 시각화, 질 변화의 관찰, 또는 질 세포학은 일반적으로 여성이 쓰레기를 잉태 한 때의 예측을 돕기 위해 사용된다 (아래 참조). 그러나, 이 방법의 어느 것도 임신을 확인할 수 없습니다. 일단 copulatory 플러그가 관찰되면, 여성은 체중 증가와 같은 임신의 표시를 위해 감시되어야 합니다.
5. 에스트라스트 사이클 스테이지 결정
- 육각 검사
참고: 쥐와 쥐의 적시 결합의 경우, 프로스트루스와 에스트루러스를 나타내는 변화에 대한 질의 시각적 관찰은 estrous 사이클 스테이지를 결정하는 가장 빠른 방법이며 특별한 장비가 필요하지 않습니다.
- 시각 방법을 사용하여 에스트라스트 사이클을 평가할 때, 광원이 질 조직의 인식된 색을 변경하고 평가를 어렵게 만들 수 있기 때문에, 방 조명과 관련하여 동일한 영역에서 육안 검사를 수행하는 것이 중요하다. 예를 들어 LED 조명에 의해 투사되는 보라색 색조는 시각적 감지를 더 어렵게 만듭니다.
- 시각적 관찰에 의해 estrous 주기의 단계를 평가하기 위해 각 마우스는 케이지 뚜껑에 앞포가 놓여있는 꼬리에 의해 수동으로 억제되어야합니다.
- 각 여성의 질 개구부는 질 영역을 둘러싼 조직의 상태와 질 개구부의 크기에 따라 평가된다. 2
- proestrus 동안, 질 개구부는 넓고 주변 조직의 팽윤을 특징으로합니다. 조직은 분홍색으로 색이 있고 매우 촉촉합니다. 종종 개구부의 등쪽 및 복부 가장자리를 따라 주름이나 조각이 있습니다.
- estrus 동안, 질 개구부를 둘러싼 조직의 팽윤이 감소하고, 조직은 촉촉하고 분홍색이 아닙니다.
- metestrus 동안 질 개구부는 최소화 하 고 무시할 수 있는 붓기가 있다.
- diestrus 도중, 질 지역 의 주위에 조직의 팽윤이 없고, 질 개구부는 작고 닫힙니다.
- 질 세포학
마우스와 쥐 모두 다각형이기 때문에, estrus 주기 길이는 4-5 일에 구역 수색하는 아주 짧습니다. 프로스트루스, 에스트루스, 자궁경, 다스트루의 네 단계를 모두 식별할 필요가 있습니다. 질 세포학은 이 단계를 결정하는 아주 정확한 방법입니다. 또한 두 가지 샘플 수집 방법이 있습니다: 질 용암의 비침습적 방법, 및 질 운하 면봉의 침습적 방법.- 질 용암
- 필요한 재료는 멸균 200 μl 파이펫 팁, 라텍스 전구, 멸균 이중 증류수 (ddH20), 깨끗한 유리 슬라이드입니다.
- 멸균 200 μl 팁 끝에 라텍스 전구를 놓습니다. 약 100 μl의 멸균 ddH2O를 파이펫에 넣습니다.
- 마우스를 케이지에서 들어 올리고 꼬리가 있는 와이어 바 케이지 위에 놓습니다.
- 꼬리를 단단히 잡고 마우스의 뒷분기를 상승시킵니다. 이제 마우스에 뚜껑을 잡고 있는 앞발만 있습니다.
- 마우스가 소변을 보는 경우 배뇨가 멈출 때까지 기다립니다. 질 운하 입구에 소변이 남아 있는 경우, ddH2O의작은 분출로 개구부가 헹구는 데 사용되었던 팁을 바꿀 수 있습니다.
- ddH2O-채워진 팁의 끝을 오리피스를 관통하지 않고 질 운하의 개구부에 놓습니다.
- 질 운하의 개통시 물 부피(~25-50 μl)의 절반까지 전구를 부드럽게 내보냅니다. 액체는 팁 삽입없이 운하에 자발적으로 흡입됩니다. 전구에 가해지는 압력을 천천히 방출합니다. 유체가 다시 팁으로 다시 들어갑니다.
- 전구에 유체의 포부를 방지하기 위해 너무 빨리 압력을 방출하지 마십시오. 필터링된 팁은 이 용도에 유용할 수 있습니다.
- 동일한 팁, 전구 및 유체를 사용하여 이전 단계를 4-5회 반복하여 단일 샘플에서 충분한 수의 세포를 얻습니다.
- 유리 슬라이드에 액체를 놓고 실온에서 얼룩이 완전히 건조되도록합니다.
- 각 마우스에 새 파이펫을 사용합니다.
- 일단 건조되면, 이 estrous 얼룩은 즉시 염색하거나 저장하고 나중에 염색할 수 있습니다. 라이트-지름사 염색은 슬라이드를 염색하는 데 가장 일반적으로 사용됩니다. 이러한 얼룩은 스테인링 과정에서 세포가 세척되는 것을 방지하기 위해 슬라이드의 고정을 필요로 하지 않는 1단계 얼룩으로서 상업적으로 사용할 수 있습니다. 슬라이드는 제조업체의 지침에 따라 45-60초 동안 얼룩에 배치됩니다.
- 슬라이드는 현미경의 밑에 그 때 검사되고, 보인 세포는 주기의 단계에 해당합니다: 1) 여성이 proestrus에 있는 경우에, 세포는 세포질보다는 더 어둡게 얼룩진 핵을 가진 둥근, 잘 형성된 핵상피세포의 클러스터로 보입니다; 2) 여성이 estrus에있는 경우, 세포의 대부분은 핵이 부족한 상피 세포, 외관에 각이며, 조밀하게 포장 된 클러스터에서 발생; 3) 여성이 자궁경상에 있는 경우에, 세포는 전형적으로 백혈구 (특히 일부 옥수수 상피 상피 세포가 존재하는 호중구)와 함께 연결된 두 개의 소시지 같이 형성되는 어둡게 얼룩진 핵을 가진; 4) diestrus 도중, 존재하는 세포는 몇몇 핵상피 세포의 발생을 가진 일반적으로 백혈구입니다..
- 질 면봉
- 필요한 재료는 직경 2mm 팁, 깨끗한 유리 현미경 슬라이드 및 멸균 생리식염수와 멸균 면 팁 어플리케이터입니다.
- 면에 기울어진 어플리케이터를 식염수로 적시다.
- 절제된 마우스의 질에 어플리케이터의 끝을 삽입합니다.
- 부드럽게 돌리고 질 벽에 팁을 굴립니다. 면봉을 조심스럽게 제거합니다.
- 셀은 슬라이드를 가로 질러 면봉을 굴려 건조 유리 슬라이드로 전달됩니다.
- 슬라이드가 건조되면 라이트-기임사 얼룩으로 얼룩질 수 있습니다.
스와빙은 스트레스가 많은 절차로 간주되며 스트레스를 받은 마우스가 스트라스트 사이클을 방해할 수 있습니다. 스와빙에 의한 질 및 자궁 경부 자극은 의사 임신을 유도할 수 있습니다. 질 점막의 반복된 면봉은 적당한 구속으로, 그리고 올바른 크기의 면봉으로 부드럽게 수행되지 않으면 손상을 일으킬 수 있습니다. 3,4
그림 2. 질 세포학 -- 설치류 estrus 주기의 다른 단계
6. 코뮬레이토리 플러그 시각화
이 플러그는 질 액과 정액으로 구성되며 12-24 h 후응성동안 질에서 지속됩니다. 플러그의 존재는 짝짓기를 확인하지만, 여성이 임신을 보장하지 않습니다. 연결된 여성이 임신한 경우 임신 첫날은 플러그가 발견된 다음 날로 간주됩니다.
- 마우스를 케이지에서 들어 올려 꼬리가 있는 와이어 바 케이지 위에 놓습니다.
- 꼬리 바로 위에 압력을 가하여 마우스를 배치하여 뒤쪽을 아치화하여 질 개구부의 더 나은 프리젠 테이션을 허용합니다.
- 그녀의 질 개구부를 관찰하여 희끄무레한 덩어리를 만드시다. 코큘라토리 플러그는 시각적으로 명확하지 않을 수 있지만 무딘 프로브를 사용하여 확인할 수 있습니다.
- 프로브의 끝을 사용하여 질 개구부에 부드럽게 삽입하십시오. 코큘리 플러그의 존재는 질 개구부의 0.5cm 내의 프로브의 발전을 방해할 것입니다.
- 프로브는 알코올에 감염되고 각 사용 전에 완전히 건조해야합니다.
암컷은 쓰레기, 생년월일, 쓰레기 크기, 태어난 숫자, 수제, 수컷:암컷 새끼의 비율, 유전자형의 비율이 모두 기록되어야 한다. 쓰레기 내의 유전자형이 부모의 유전자형에 해당하지 않는 경우, 진정한 유전자형을 확인하기 위해 재검사를 수행해야 합니다.
7화 위닝
쥐와 쥐에 대한 임신은 약 21 일입니다. 젊은 나이의 21-28 일에 짜인다. 쥐와 쥐 모두 이른 8 주 까지 번식 할 수 있으므로 새끼는 어린 나이에 성별에 의해 분리되는 것이 필수적입니다. 집중적인 번식은 다음 쓰레기가 태어날 때 오래된 새끼가 존재하지 않도록 하기 위해 20일째에 각 쓰레기의 새끼를 사육해야 합니다. 비집중적 번식을 위해 새끼는 20 일 의 나이를 지나서 어머니와 함께 남겨질 수 있으며, 종종 28 일까지. 이것은 새끼가 비 엔지니어링 또는 야생 형 동물만큼 활발하지 않을 수 있기 때문에 많은 유전자 변형 균주에 매우 도움이 될 수 있습니다.
남성과 여성 새끼는 짜기에서 분리됩니다. 가능하면 새로 새끼를 노래해서는 안됩니다. 쓰레기가 주어진 성별의 한 새끼만 포함하는 경우, 시도는 같은 성별의 다른 사람과이 강아지를 수용할 수 있어야합니다. 가능한 주택 옵션은 : 1) 단일 여성 강아지는 집중 번식 케이지에없는 경우 어머니와 함께 남아있을 수 있습니다; 2) 단일 여성 또는 남성 새끼는 같은 나이의 다른 쓰레기에서 다른 동성 새끼와 함께 배치 될 수있다; 3) 부모가 일부일처 쌍인 경우, 여성은 하나의 남성 새끼가 아버지와 함께 수용 될 수 있도록 케이지에서 제거 할 수 있습니다; 그리고 4) 단일 남성 강아지는 5 주까지 여성 형제자매와 함께 수용 될 수있다. 새끼의 성별은 원치 않는 쓰레기가 부적절하게 분리 된 새끼를 방지하기 위해 일주일 후 확인되어야한다.
쥐와 쥐는 번성 하는 것을 보장 하기 위해 매일 검사 해야 합니다. 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드5 는 음식이 대변과 소변에 의해 더럽히는 것을 방지하기 위해 동물에게 제시되어야한다고 명시하고 있지만, 새로 짜여진 마우스는 케이지 바닥에 유리 접시 (페트리 접시)에 배치 된 소량의 음식 (마우스 당 1 펠릿)을 제공해야합니다. 이것은 동물이 유일한 음식 근원으로 설치류 차우를 갖는 전환하도록 격려할 것입니다. 자동 급수 시스템을 통해 케이지에 물을 공급하는 랙에 보관되어 있는 동물의 경우에도 마우스가 탈수된 것처럼 보이는 경우 물병을 케이지에 추가할 수 있습니다.
| 이름 |
콜로니 타입 |
묘사 |
| ICR |
아웃레드 |
흰둥이 |
| 스위스 웹스터 |
아웃레드 |
흰둥이 |
| 발브/c |
인브레드 |
흰둥이 |
| FVB |
인브레드 |
흰둥이 |
| C57BL/6 |
인브레드 |
블랙 코트 칼라 |
| C3H |
인브레드 |
브라운 코트 칼라 |
| DBA/2 |
인브레드 |
브라운/그레이 코트 칼라 |
| 아티믹 누드 (nu/nu) |
인브레드 |
사나이 |
| SCID |
인브레드 |
심한 결합 면역 절제 마우스 -다양한 코트 색상 |
표 1. 일반적으로 사용되는 마우스 얼룩과 주식.
| 이름 |
콜로니 타입 |
묘사 |
| 스프라그-다울리 |
아웃레드 |
흰둥이 |
| 위스타 (주) |
아웃레드 |
흰둥이 |
| 피셔 344 |
인브레드 |
흰둥이 |
| 루이스 |
인브레드 |
흰둥이 |
| 롱 에반스 |
인브레드 |
후드, 블랙, 화이트 |
표 2. 일반적으로 사용되는 쥐 균주와 주식.
