세포 사멸 분석: 세포 독성 능력의 크롬 방출 분석

Overview

출처: 프랜시스 V. 자아스타드^1,2,휘트니 스완슨^2,3,토마스 에스 그리피스^1,2,3,4
¹ 미생물학, 면역학 및 암 생물학 대학원 프로그램, 미네소타 대학교, 미니애폴리스, MN 55455
² 면역학 센터, 미네소타 대학, 미니애폴리스, MN 55455
³ 미네소타 대학교 비뇨기과, 미니애폴리스, MN 55455
⁴ Masonic 암 센터, 미네소타 대학, 미니애폴리스, MN 55455

면역 계통의 세포의 주요 기능 의 한은 바이러스에 감염되었거나 종양 세포로 변환을 겪은 표적 세포를 제거하는 것입니다. 면역 세포의 세포 독성 용량을 측정하기위한 체외 분석을 수년 동안 실험실에서 주식으로 되어 왔습니다. 이러한 소약은 T 세포, NK 세포 또는 항원 특이적 또는 비특이적 방식으로 표적 세포를 죽이는 다른 면역 세포의 능력을 결정하는 데 사용되었습니다. 데스 리간드(예를 들어, 파스 리간드 또는 트레일), 사이토카인(예를 들어, IFNg 또는 TNF), 또는 이펙터 세포에 의해 발현된 세포독성 과립(즉, 페포린/그란자임 B)은 표적 세포 사멸을 유도할 수 있는 몇 가지 방법이다. 최근 몇 년 동안 종양 면역 요법 연구의 폭발로 환자 결과를 개선하기 위해 면역 세포의 세포 독성 활성을 증가시키는 에이전트를 찾는 데 관심이 증가하고 있습니다. 반대로, 몇몇 질병은 면역 세포 중독 활동의 과잉 활동으로 특징지어집니다, 이 반응을 강화하는 에이전트를 확인하는 노력의 결과로. 따라서, 사용자가 실험 설계에 임의의 상이한 이펙터 세포, 표적 세포 및/또는 반응 수정자를 쉽게 통합할 수 있는 분석체는 표적 세포의 세포 독성 용량 및/또는 반응성을 신속하게 평가하는 귀중한 수단으로 작용할 수 있다.

이러한 시험관 내 아세약은 다른 세포 집단의 혼합뿐만 아니라 이펙터 및 표적 세포 모두의 상대적으로 낮은 수를 사용하는 것을 포함한다. 따라서, 분석의 한 가지 필요성은 표적 세포를 쉽게 검출하고 수량화할 수 있는 방식으로 라벨을 부착하여 사용자가 이펙터 세포에 의해 매개되는 '백분율 특이용 용해'를 결정할 수 있도록 하는 것이다. 방사능 -특히, 크롬 51⁽⁵¹Cr)의 형태로 Na₂⁵¹CrO₄- 표적 세포 내의 신속하고 비구체적으로 라벨 세포 단백질을 저렴한 방법입니다 (1). 짧은 라벨링 및 총 분석 시간은 분석의 결과에 영향을 미칠 수 있는 표적 세포의 수 및/또는 표현형에 있는 중요한 변경에 대한 잠재력을 감소시킵니다. 이펙터 세포의 세포 독성 활성의 결과로 표적 세포의 막 무결성의 상실시, 대상 세포 내의 ⁵¹Cr 라벨 세포 단백질은 배양 상수로 방출되어 양수에 사용할 수 있게 된다. 시험관 내면역 세포의 기능을 검사하는 분석과 마찬가지로 실험의 성능을 개선하는 것을 고려하는 중요한 고려 사항이 많이 있습니다. 가장 중요한 특징 중 하나는 건강한 이펙터 (최대 세포 독성 활성)와 대상 (최대 반응성과 최소한의 자발적 사망 /⁵¹Cr 방출) 세포를 사용하는 것입니다. 이펙터 및 표적 세포 접촉이 요구된다(세포-세포 접촉을 장려하기 위해 라운드 하단 96-웰 플레이트의 일반적인 사용으로 이어지도록 유도) (2). 마지막으로, 데이터 분석은 양수 및 음극대상 세포 집단의 포함에 의존한다.

다음 프로토콜은 유로피움을 이용한 비방사성 버전이 최근에 개발되었지만, 이펙터 세포의 집단의 세포 독성 능력을 측정하기 위한 표준 ⁵¹Cr 방출 분석기를 수행하기 위한 단계를 설명할 것입니다. ⁵¹ Cr은 강력한 γ 방사선 방출기입니다. 따라서 이 분석법의 사용에는 적절한 방사선 안전 교육, 전용 실험실 공간, 감마 카운터 및 방사성 시료 의 폐기가 필요합니다.

이 분석기의 일반적인 이벤트 순서는 다음과 같습니다: 1) ⁵¹Cr 라벨 대상을 준비; 2) 대상 세포가 라벨링하는 동안 이펙터 세포를 준비하고 접시에 추가; 3) 플레이트에 레이블이 붙은 대상을 추가합니다. 4) 인큐베이션 플레이트; 5) 수퍼나일체 수확; 및 6) 카운터에서 샘플을 실행한 후 데이터를 분석합니다. 샘플은 일반적으로 triplicate에서 제조된 다음 미묘한 파이펫팅 차이를 설명하기 위해 평균화됩니다.

적절한 PPE는이 분석에 중요합니다. 특히, 사용자는 실험실 코트와 장갑을 착용해야합니다. 안전 안경은 실험실 이나 기관에 따라 필요할 수 있습니다. 모든 단계에서 ⁵¹Cr을 안전하게 보관하고 사용할 수 있는 충분한 리드 차폐가 있어야 합니다. 마지막으로, ⁵¹Cr을 사용하는 전용 실험실 공간과 장비가 있어야 하며, ^51Cr을가진 시료가 보관되는 위치를 나타내는 모든 적절한 사이니지와 감마 프로브가 장착된 가이거 카운터를 포함하여 오염 가능한 오염을 위한 공간을 조사해야 합니다.

본 실험실 운동에서는 인간 흑색종 세포를 죽이는 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC), (CpG 자극 대 자극) 인간 흑색종 세포주 WM793를 모델및 크롬 방출 분석으로 결정할 것이다.

Procedure

절차 개요

세포 사멸 측정을 위한 일반적인 ^51Cr방출 분석법은 다음 단계를 포함합니다:

먼저, 표적 셀은 Na₂^[51Cr]O_4로표지된다. 이것은 분석기의 이펙터 세포와 구별됩니다.
표적 세포가 라벨링하는 동안, 이펙터 셀이 수집되고, 직렬 희석 기술을 이용하여, 이펙터 세포의 감소적 적정은 라운드 하단 96-tassay 플레이트에서 생성된다.
표적 세포 라벨링의 끝에서, 세포는 먼저 세척되고 그 후 고정된 수의 세포가 이미 일련의 이펙터 세포 희석제를 포함하는 분석 판에 첨가된다.
다음으로, 표적 이펙터 세포 혼합은 표적 세포와 충분한 세포 상호 작용을 허용하고 세포 용액을 중재하기 위해 정의된 기간 동안 배양된다.
마지막으로, 문화 슈퍼 나일체는 수확하고 튜브로 수집됩니다. ⁵¹Cr 양은 감마 카운터를 사용하여 양화됩니다.
결국, 데이터는 수집되어 대상 셀의 "백분율 특정 셀 용해"를 계산하는 데 사용됩니다.

1. ⁵¹Cr로 대상 셀 라벨링

시작하려면, 표적 세포(여기-인간 흑색종 세포주 WM793)를 단일 세포 현탁액으로 준비한다.
이렇게하려면 먼저 조직 배양플라스크에서 미디어를 제거하십시오.
그런 다음, 1X PBS의 5mL로 세포를 씻는다.
-2 분 동안 접시에 트립신 1 mL을 추가하여 세포를 트립시인화합니다.
플라스크를 부드럽게 눌러 플라스크 표면에서 세포를 느슨하게 합니다.
플라스크에 RPMI 미디어 5mL을 추가하고 미디어를 위아래로 파이프하여 세포를 분리합니다.
세포 현탁액을 15mL 원칼 튜브로 수집하고 1200 rpm에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상체를 장식합니다.
펠릿에 10mL의 미디어를 추가하고 미디어를 위아래로 부드럽게 파이프하여 세포를 현탁액으로 가져옵니다.
혈종계를 사용하여 세포 농도를 결정합니다.
새로운 15 mL 원문 튜브로 1x10⁶ 세포를 전송합니다.
1200 rpm에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리하고 상체를 데칭합니다.
튜브를 잠시 소용돌이쳐 소량의 중간 체적으로 세포 펠릿을 다시 일시 적으로 돌보냅니다.
WM793 대상 셀 서스펜션에 ⁵¹Cr의 100 μCi를 직접 추가합니다.
참고: 특정 방사능에 대한 전용 실험실 공간이 설정되어야 합니다. 또한 모든 단계에서 ⁵¹Cr을 안전하게 보관하고 사용하기위한 충분한 납 차폐뿐만 아니라 ⁵¹Cr이있는 샘플이 보관되는 위치를 나타내는 적절한 사이니지가 있어야합니다. 팬케이크 프로브가 장착된 가이거 카운터도 필요한데, 오염 가능성을 조사하기 위해.
튜브가 이제 방사능임을 나타내기 위해 작은 방사성 테이프를 튜브에 추가합니다.
튜브를 납 쉴드가 있는 37°C 인큐베이터에 놓고 1시간 동안 배양합니다. 크롬의 표적 세포 섭취량을 증가시키기 위해 15-20 분마다 튜브를 쓸어 넘깁니다.
인큐베이션 기간 후, FBS의 5mL로 대상 세포를 세척하여 초과 ⁵¹Cr을 제거하십시오.
5 분 동안 1200 rpm에서 세포를 원심 분리합니다. 방사능 FBS는 적절한 폐기물 용기로 세척합니다.
펠릿을 다시 중단하고 FBS로 두 번째로 세척하십시오. 가이거 카운터를 사용하여 통합 방사능펠릿을 확인하십시오.
10mL 완전 배지에서 펠릿을 다시 중단하여¹⁰⁵ 셀/mL의 세포 농도를 달성한다.
참고: ⁵¹Cr 라벨링 후 셀 카운팅 단계는 안전상의 이유로 주로 여기에서 생략됩니다. WM793 세포 농도가 ⁵¹Cr 라벨링 이전과 동일하다고 가정할 수 있다.

2. 이펙터 셀 준비

인간 또는 마우스 T 세포 및 NK 세포와 같은 다양한 이펙터 셀을 사용할 수 있다. 이 예에서, 표준 밀도 그라데이션 원심분리(5x10^6의농도)에 의해 전혈에서 분리된 PBMC가 사용되었다.
시작하려면 96웰의 둥근 바닥 플레이트의 행 하나(여기 행 A, 표 1 참조)의모든 웰에 100 μL의 조직 배양 배지를 추가합니다. 여기서, 이펙터 세포가 첨가되지 않으며, 대상 세포로부터 "최소/자발적 ⁵¹Cr 방출"을 결정하기 위한 '공백'으로 작용할 것이다.

표 1: ⁵¹Cr 방출 분석 레이아웃: 행 A-대상 셀(104셀/100 μL)은 미디어만으로 배양됩니다("최소/자발적 ⁵¹Cr 릴리스"를 결정하기 위한 '공백'을 생성합니다). 다른 이펙터를 포함하는 행 B - C- 우물 : 대상 셀 (E:T) 비율, 50:1에서 1.5:1에 이르기까지. 행 H-표적 셀(104셀/100 μL)은 1% NP-40(NP-40은 표적 세포를 lyses하여 "최대 또는 총 ^51Cr방출")을 생성한다. 모든 E:T 비율은 모든 실험 조건에 대해 삼중에서 테스트됩니다. 열 1-3- 자극되지 않은 PBMC 및 열 4-6- CpG 자극 PBMC.

다음으로, PBMC의 2X 직렬 셀 희석(각 실험 조건에 대한 삼중분리)을 생성하여 5x10^내지 15,625세포/100 μL에 이르는 이펙터 세포 농도를 얻습니다(여기 행 B내지 G).
참고: 이 예에서 시작 효과자: 대상 셀(E: T) 비율은 50:1입니다. 그러나, 이 비율은 실험적인 세부사항에 따라 조정될 수 있다.
이러한 웰에 이펙터 셀을 추가하지 않음으로써 마지막 행(여기 행 H)을 비워 둡니다. 이 행은 "총 카운트/분, 또는 (c.p.m) 또는 "최대 ⁵¹Cr 릴리스"를 생성하는 데 사용됩니다.
대상 셀을 추가할 준비가 될 때까지 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣습니다.

3. 분석지에 ⁵¹Cr 라벨 WM793 대상 셀 추가

인큐베이션 기간 이후에는 인큐베이터에서 표적 세포를 제거하고 5mL의 FBS로 세척하여 초과 ⁵¹Cr을 제거합니다.
지정된 원심분리기를 사용하여 5분 동안 1200 rpm에서 세포를 원심분리합니다.
FBS 세척(방사성 상수)을 적절한 폐기물 용기에 제거합니다.
FBS의 신선한 5mL에서 펠릿을 다시 중단하여 세척 단계를 반복합니다.
원심 분리는 5 분 동안 1200 rpm에서 세포를 다시 분리합니다.
마지막으로, 완전한 매체의 10 mL에서 펠릿을 다시 중단합니다.
⁵¹Cr 라벨WM793 셀 서스펜션(10⁵ 셀/mL)을 일회용 시약 저장소에 붓습니다.
그런 다음, 다중 채널 파이펫을 사용하여, 96 웰 이펙터 세포 판의 각 웰에, 이러한 표지 대상 셀의 100 μL을 추가합니다.
다음으로, 1% NP-40(물)의 100 μL을 이펙터 세포가 없는 우물행에 추가합니다(여기 행 H). 1% NP-40은 표적 셀을 lyse 것이며, 따라서 이러한 우물은 "총 카운트/분, 또는 (c. p.m) 또는 최대 ⁵¹Cr 방출을 결정하는 컨트롤 역할을 합니다.
플레이트의 양쪽에 작은 가스 투과 성 테이프를 추가하여 플레이트에 뚜껑을 고정하고 ⁵¹Cr이 포함되어 있음을 나타내기 위해 뚜껑에 방사성 테이프 조각을 배치합니다.
간단히, 원심 분리판에서 1200 rpm. 하나의 실험 플레이트만 사용 중인 경우 원심분리기에 밸런스 플레이트를 추가합니다.
참고: 방사성 샘플을 처리하기 위해 표시된 원심분리기를 사용하는 것이 중요합니다.
원심분리기에서 접시를 제거합니다.
플레이트를 37°C 인큐베이터에 작은 납 차폐물로 배치하여 추가 안전을 위해 플레이트 위에 차폐합니다. 대상 세포 용해를 허용하기 위해 16 h에 대한 인큐베이션.
참고: 잠복기는 사용된 이펙터 세포 및 사용된 살인의 잠재적인 기계장치에 따라 4에서 18h까지 다양할 수 있습니다.

4. 수퍼네티츠 수확

인큐베이션 기간이 끝나면 플레이트 가장자리 주변의 테이프를 조심스럽게 제거하고 뚜껑을 제거합니다.
다음으로, 각 면 플러그에 대해 작은 필터 디스크가 제자리에 있는지 확인하여 접시에 수확 프레임을 배치합니다. 이렇게 하면 셀 프리 상수의 수집이 보장됩니다.
이제 면 플러그를 우물에 천천히 부드럽게 누릅니다.
약 10초 후에 면 플러그의 압력을 해제한 다음 면 플러그를 튜브 스트립으로 옮습니다.
이러한 각 튜브를 보조 FACS 튜브에 넣습니다.
마지막으로, FACS 튜브를 감마 카운터에 로드하고 샘플을 실행하여 각 조건에서 방출되는 ⁵¹Cr의 양을 양량화합니다. 샘플은 일반적으로 1분 동안 측정되므로 "카운트/분"을 쉽게 측정할 수 있습니다.
조심스럽게 튜브가 카운터에 로드된 순서를 기록합니다.

5. 데이터 분석

여기서, 자극받지 않은 PBMC는 처음 3개의 열에 추가되었고, CpG 자극 된 PBMC (CpG ODN, (1 μg/mL)를 24 시간 동안 열4-6에 첨가하였다. 표 2를 참조하십시오.

	1	2	3	4	5	6	7	8
A	1251	1157	1086	917	1118	1140
B	1832	1986	1971	7629	7913	8180
C	1677	1739	1428	5454	5055	5268
D	1638	1552	1734	4239	3582	3786
E	1658	1580	1339	2818	2623	2750
F	1579	1472	1483	2028	1779	1769
G	1326	1325	1184	1801	1654	1565
H	9220	9367	8067	8774	9647	8236
나는	A1, A2, A3 -> 평균		1164.67	자발적인 c.p.m		1058.33
J	평균 B1, B2, B3 ->		1929.67	9.91%		7907.33	87.50%	50:1
K	C1, C2, C3 -> 평균		1614.67	5.83%		5259	53.67%	25:1
L	평균 D1,D2,D3 ->		1641.33	6.17%		3869	35.91%	12.5:1
M	평균 E1, E2, E3 ->		1525.67	4.68%		2730.33	21.36%	6.25:1
N	평균 F1, F2, F3 ->		1511.33	4.49%		1858.67	10.22%	3.12:1
O	G1, G2, G3 -> 평균		1278.33	1.47%		1673.33	7.86%	1.56:1
P	평균 H1, H2, H3 ->		8884.67	최대 c.p.m		8885.67
				팀없는 PBMC			CpG-stim PBMC	E:T 비율

표 2: ⁵¹Cr 릴리스 분석 데이터: '분당 카운트' / 'c. p.m' 데이터 값, 평균 c. p. p.m 값, 계산퍼센트 별 리시스 값.

수집된 데이터(분당 카운트, 즉 .c.p.m)는 샘플이 원래 플레이트에 배치된 것과 동일한 방식으로 스프레드시트의 셀에 입력하였다.
첫째, 삼중기의 평균이 계산되었습니다. 표 2 - C3에서 P3까지, 자극되지 않은 PBMC 및 세포 I6 ~P6, CpG 자극 된 PBMC용.
평균이 결정되면 각 조건에 대한 특정 용해의 백분율은 다음 수식을 사용하여 계산되었습니다.
특정 용해의 백분율은 각 조건에 대해 계산되었다 (표 2 - 세포 J4 O4, 자극되지 않은 PBMC및 O7에 대한, 자극되지 않은 PBMC에 대한).

Results

이 예에서, 이펙터 세포는 CpG(도 1, 흑원)로자극되어 표적 세포에 대한 이펙터 세포의 비율이 증가함에 따라 대상 세포를 보다 효과적으로 죽였다. 이러한 증가는 자극되지 않은 PBMC(백색원)에서관찰되지 않았으며, 이는 표적 세포 용해의 관찰된 증가에 CpG 자극이 필요하다는 것을 나타낸다.

도 1: ⁵¹Cr 분석산란 플롯: 인간 PBMC에 의한 종양활성, 자극되지 않은(백색원) 및 CpG(블랙서클)로자극후 다른 이펙터에서 테스트: 표적 세포 비율(E: T) 비율(50:1 ~1.5:1).

Application and Summary

여기에 기재된 분석체는 상당한 유연성을 가지며, 다양한 이펙터 및 표적 세포가 묻는 질문에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 이펙터 세포 특이성은 상이한 표적 세포 또는 이펙터 세포 살상 메커니즘을 사용하여 특정 단백질에서 결핍된 세포를 사용하거나 단백질 특이적 억제제를 사용하여 결정될 수 있다. ⁵¹Cr 방출 분석의 주요 문제는 대상 셀에 의한 높은 자발적 방출 속도에 대한 잠재력입니다. 단독으로 배양할 때(이펙터 셀 없이), 대상 셀에 의한 ⁵¹Cr의 자발적인 방출은 대상 세포에 의해 방출되는 총("최대")의 30% 이상이어야 한다. 더 높은 자발적 방출 속도 건강에 해로운 대상 세포를 사용 하 여 때문일 수 있습니다., 가난한 건강 으로 인해 (예를 들어, 세포줄의 확장 된 문화) 또는 지나치게 긴 라벨 기간.

References

Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C. and Chapuis. B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on ⁵¹Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology, 14 (2):181-196, (1968).
Kemp, T. J., B. D. Elzey, and T. S. Griffith. Plasmacytoid dendritic cell-derived IFN-alpha induces TNF-related apoptosis-inducing ligand/Apo-2L-mediated antitumor activity by human monocytes following CpG oligodeoxynucleotide stimulation. The Journal of Immunology, 171 (1): 212-218, (2003).

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절차 개요

세포 사멸 측정을 위한 일반적인 ^51Cr방출 분석법은 다음 단계를 포함합니다:

먼저, 표적 셀은 Na₂^[51Cr]O_4로표지된다. 이것은 분석기의 이펙터 세포와 구별됩니다.
표적 세포가 라벨링하는 동안, 이펙터 셀이 수집되고, 직렬 희석 기술을 이용하여, 이펙터 세포의 감소적 적정은 라운드 하단 96-tassay 플레이트에서 생성된다.
표적 세포 라벨링의 끝에서, 세포는 먼저 세척되고 그 후 고정된 수의 세포가 이미 일련의 이펙터 세포 희석제를 포함하는 분석 판에 첨가된다.
다음으로, 표적 이펙터 세포 혼합은 표적 세포와 충분한 세포 상호 작용을 허용하고 세포 용액을 중재하기 위해 정의된 기간 동안 배양된다.
마지막으로, 문화 슈퍼 나일체는 수확하고 튜브로 수집됩니다. ⁵¹Cr 양은 감마 카운터를 사용하여 양화됩니다.
결국, 데이터는 수집되어 대상 셀의 "백분율 특정 셀 용해"를 계산하는 데 사용됩니다.

1. ⁵¹Cr로 대상 셀 라벨링

시작하려면, 표적 세포(여기-인간 흑색종 세포주 WM793)를 단일 세포 현탁액으로 준비한다.
이렇게하려면 먼저 조직 배양플라스크에서 미디어를 제거하십시오.
그런 다음, 1X PBS의 5mL로 세포를 씻는다.
-2 분 동안 접시에 트립신 1 mL을 추가하여 세포를 트립시인화합니다.
플라스크를 부드럽게 눌러 플라스크 표면에서 세포를 느슨하게 합니다.
플라스크에 RPMI 미디어 5mL을 추가하고 미디어를 위아래로 파이프하여 세포를 분리합니다.
세포 현탁액을 15mL 원칼 튜브로 수집하고 1200 rpm에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상체를 장식합니다.
펠릿에 10mL의 미디어를 추가하고 미디어를 위아래로 부드럽게 파이프하여 세포를 현탁액으로 가져옵니다.
혈종계를 사용하여 세포 농도를 결정합니다.
새로운 15 mL 원문 튜브로 1x10⁶ 세포를 전송합니다.
1200 rpm에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리하고 상체를 데칭합니다.
튜브를 잠시 소용돌이쳐 소량의 중간 체적으로 세포 펠릿을 다시 일시 적으로 돌보냅니다.
WM793 대상 셀 서스펜션에 ⁵¹Cr의 100 μCi를 직접 추가합니다.
참고: 특정 방사능에 대한 전용 실험실 공간이 설정되어야 합니다. 또한 모든 단계에서 ⁵¹Cr을 안전하게 보관하고 사용하기위한 충분한 납 차폐뿐만 아니라 ⁵¹Cr이있는 샘플이 보관되는 위치를 나타내는 적절한 사이니지가 있어야합니다. 팬케이크 프로브가 장착된 가이거 카운터도 필요한데, 오염 가능성을 조사하기 위해.
튜브가 이제 방사능임을 나타내기 위해 작은 방사성 테이프를 튜브에 추가합니다.
튜브를 납 쉴드가 있는 37°C 인큐베이터에 놓고 1시간 동안 배양합니다. 크롬의 표적 세포 섭취량을 증가시키기 위해 15-20 분마다 튜브를 쓸어 넘깁니다.
인큐베이션 기간 후, FBS의 5mL로 대상 세포를 세척하여 초과 ⁵¹Cr을 제거하십시오.
5 분 동안 1200 rpm에서 세포를 원심 분리합니다. 방사능 FBS는 적절한 폐기물 용기로 세척합니다.
펠릿을 다시 중단하고 FBS로 두 번째로 세척하십시오. 가이거 카운터를 사용하여 통합 방사능펠릿을 확인하십시오.
10mL 완전 배지에서 펠릿을 다시 중단하여¹⁰⁵ 셀/mL의 세포 농도를 달성한다.
참고: ⁵¹Cr 라벨링 후 셀 카운팅 단계는 안전상의 이유로 주로 여기에서 생략됩니다. WM793 세포 농도가 ⁵¹Cr 라벨링 이전과 동일하다고 가정할 수 있다.

2. 이펙터 셀 준비

인간 또는 마우스 T 세포 및 NK 세포와 같은 다양한 이펙터 셀을 사용할 수 있다. 이 예에서, 표준 밀도 그라데이션 원심분리(5x10^6의농도)에 의해 전혈에서 분리된 PBMC가 사용되었다.
시작하려면 96웰의 둥근 바닥 플레이트의 행 하나(여기 행 A, 표 1 참조)의모든 웰에 100 μL의 조직 배양 배지를 추가합니다. 여기서, 이펙터 세포가 첨가되지 않으며, 대상 세포로부터 "최소/자발적 ⁵¹Cr 방출"을 결정하기 위한 '공백'으로 작용할 것이다.

표 1: ⁵¹Cr 방출 분석 레이아웃: 행 A-대상 셀(104셀/100 μL)은 미디어만으로 배양됩니다("최소/자발적 ⁵¹Cr 릴리스"를 결정하기 위한 '공백'을 생성합니다). 다른 이펙터를 포함하는 행 B - C- 우물 : 대상 셀 (E:T) 비율, 50:1에서 1.5:1에 이르기까지. 행 H-표적 셀(104셀/100 μL)은 1% NP-40(NP-40은 표적 세포를 lyses하여 "최대 또는 총 ^51Cr방출")을 생성한다. 모든 E:T 비율은 모든 실험 조건에 대해 삼중에서 테스트됩니다. 열 1-3- 자극되지 않은 PBMC 및 열 4-6- CpG 자극 PBMC.

다음으로, PBMC의 2X 직렬 셀 희석(각 실험 조건에 대한 삼중분리)을 생성하여 5x10^내지 15,625세포/100 μL에 이르는 이펙터 세포 농도를 얻습니다(여기 행 B내지 G).
참고: 이 예에서 시작 효과자: 대상 셀(E: T) 비율은 50:1입니다. 그러나, 이 비율은 실험적인 세부사항에 따라 조정될 수 있다.
이러한 웰에 이펙터 셀을 추가하지 않음으로써 마지막 행(여기 행 H)을 비워 둡니다. 이 행은 "총 카운트/분, 또는 (c.p.m) 또는 "최대 ⁵¹Cr 릴리스"를 생성하는 데 사용됩니다.
대상 셀을 추가할 준비가 될 때까지 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣습니다.

3. 분석지에 ⁵¹Cr 라벨 WM793 대상 셀 추가

인큐베이션 기간 이후에는 인큐베이터에서 표적 세포를 제거하고 5mL의 FBS로 세척하여 초과 ⁵¹Cr을 제거합니다.
지정된 원심분리기를 사용하여 5분 동안 1200 rpm에서 세포를 원심분리합니다.
FBS 세척(방사성 상수)을 적절한 폐기물 용기에 제거합니다.
FBS의 신선한 5mL에서 펠릿을 다시 중단하여 세척 단계를 반복합니다.
원심 분리는 5 분 동안 1200 rpm에서 세포를 다시 분리합니다.
마지막으로, 완전한 매체의 10 mL에서 펠릿을 다시 중단합니다.
⁵¹Cr 라벨WM793 셀 서스펜션(10⁵ 셀/mL)을 일회용 시약 저장소에 붓습니다.
그런 다음, 다중 채널 파이펫을 사용하여, 96 웰 이펙터 세포 판의 각 웰에, 이러한 표지 대상 셀의 100 μL을 추가합니다.
다음으로, 1% NP-40(물)의 100 μL을 이펙터 세포가 없는 우물행에 추가합니다(여기 행 H). 1% NP-40은 표적 셀을 lyse 것이며, 따라서 이러한 우물은 "총 카운트/분, 또는 (c. p.m) 또는 최대 ⁵¹Cr 방출을 결정하는 컨트롤 역할을 합니다.
플레이트의 양쪽에 작은 가스 투과 성 테이프를 추가하여 플레이트에 뚜껑을 고정하고 ⁵¹Cr이 포함되어 있음을 나타내기 위해 뚜껑에 방사성 테이프 조각을 배치합니다.
간단히, 원심 분리판에서 1200 rpm. 하나의 실험 플레이트만 사용 중인 경우 원심분리기에 밸런스 플레이트를 추가합니다.
참고: 방사성 샘플을 처리하기 위해 표시된 원심분리기를 사용하는 것이 중요합니다.
원심분리기에서 접시를 제거합니다.
플레이트를 37°C 인큐베이터에 작은 납 차폐물로 배치하여 추가 안전을 위해 플레이트 위에 차폐합니다. 대상 세포 용해를 허용하기 위해 16 h에 대한 인큐베이션.
참고: 잠복기는 사용된 이펙터 세포 및 사용된 살인의 잠재적인 기계장치에 따라 4에서 18h까지 다양할 수 있습니다.

4. 수퍼네티츠 수확

인큐베이션 기간이 끝나면 플레이트 가장자리 주변의 테이프를 조심스럽게 제거하고 뚜껑을 제거합니다.
다음으로, 각 면 플러그에 대해 작은 필터 디스크가 제자리에 있는지 확인하여 접시에 수확 프레임을 배치합니다. 이렇게 하면 셀 프리 상수의 수집이 보장됩니다.
이제 면 플러그를 우물에 천천히 부드럽게 누릅니다.
약 10초 후에 면 플러그의 압력을 해제한 다음 면 플러그를 튜브 스트립으로 옮습니다.
이러한 각 튜브를 보조 FACS 튜브에 넣습니다.
마지막으로, FACS 튜브를 감마 카운터에 로드하고 샘플을 실행하여 각 조건에서 방출되는 ⁵¹Cr의 양을 양량화합니다. 샘플은 일반적으로 1분 동안 측정되므로 "카운트/분"을 쉽게 측정할 수 있습니다.
조심스럽게 튜브가 카운터에 로드된 순서를 기록합니다.

5. 데이터 분석

여기서, 자극받지 않은 PBMC는 처음 3개의 열에 추가되었고, CpG 자극 된 PBMC (CpG ODN, (1 μg/mL)를 24 시간 동안 열4-6에 첨가하였다. 표 2를 참조하십시오.

	1	2	3	4	5	6	7	8
A	1251	1157	1086	917	1118	1140
B	1832	1986	1971	7629	7913	8180
C	1677	1739	1428	5454	5055	5268
D	1638	1552	1734	4239	3582	3786
E	1658	1580	1339	2818	2623	2750
F	1579	1472	1483	2028	1779	1769
G	1326	1325	1184	1801	1654	1565
H	9220	9367	8067	8774	9647	8236
나는	A1, A2, A3 -> 평균		1164.67	자발적인 c.p.m		1058.33
J	평균 B1, B2, B3 ->		1929.67	9.91%		7907.33	87.50%	50:1
K	C1, C2, C3 -> 평균		1614.67	5.83%		5259	53.67%	25:1
L	평균 D1,D2,D3 ->		1641.33	6.17%		3869	35.91%	12.5:1
M	평균 E1, E2, E3 ->		1525.67	4.68%		2730.33	21.36%	6.25:1
N	평균 F1, F2, F3 ->		1511.33	4.49%		1858.67	10.22%	3.12:1
O	G1, G2, G3 -> 평균		1278.33	1.47%		1673.33	7.86%	1.56:1
P	평균 H1, H2, H3 ->		8884.67	최대 c.p.m		8885.67
				팀없는 PBMC			CpG-stim PBMC	E:T 비율

표 2: ⁵¹Cr 릴리스 분석 데이터: '분당 카운트' / 'c. p.m' 데이터 값, 평균 c. p. p.m 값, 계산퍼센트 별 리시스 값.

수집된 데이터(분당 카운트, 즉 .c.p.m)는 샘플이 원래 플레이트에 배치된 것과 동일한 방식으로 스프레드시트의 셀에 입력하였다.
첫째, 삼중기의 평균이 계산되었습니다. 표 2 - C3에서 P3까지, 자극되지 않은 PBMC 및 세포 I6 ~P6, CpG 자극 된 PBMC용.
평균이 결정되면 각 조건에 대한 특정 용해의 백분율은 다음 수식을 사용하여 계산되었습니다.
특정 용해의 백분율은 각 조건에 대해 계산되었다 (표 2 - 세포 J4 O4, 자극되지 않은 PBMC및 O7에 대한, 자극되지 않은 PBMC에 대한).

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